基因操作原理 2011级基因操作原理课堂实验设计练习.docxVIP

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2017-04-13 发布于浙江
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基因操作原理 2011级基因操作原理课堂实验设计练习.docx

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实验设计：如图，图中标示酶切位点为单酶切位点，PLTR是真核启动子序列。EcoRV酶切后产生平末端，Sal 1 和Xho 1 是同尾酶；目的蛋白A由小鼠a基因编码，序列已知，a基因已克隆到pUC18上，命名为pUC A；请设计实验方案，获得A蛋白及其抗体。解答:切: 用Eco RⅠ和Sal Ⅰ酶切pUC A获得a 基因片段同时用Eco RⅠ和xhoⅠ酶切pRSVneo连: 用DNA连接酶将上述酶切后片段相连.转: 用感受态细胞转化法将上述重组子转入大肠杆菌中检: 用载体上的Ap抗性进行抗性筛选,能在Ap抗性平板上生长的即为含有目的基因的宿主菌.挑选转化子,提取质粒,进行酶切鉴定,同时测序,确证正确重组质粒。提取质粒: 从筛选出的转化子中用碱裂解法提取质粒.转染: 将构建完的载体通过转染(阳离子载体或者脂质体法)或直接导入(电穿孔)法导入T细胞,在含G418的培养基上培养.挑选耐受G418菌落并进行单克隆化.裂解耐受G418细胞纯化A蛋白抗体的获得: 用A蛋白感染免疫小鼠,提取小鼠免疫细胞和肿瘤细胞制备杂交瘤细胞获得单克隆抗体.抗体制备：以纯化得到的A蛋白作为抗原，免疫小鼠，使其产生致敏B淋巴细胞。处死小鼠，取出小鼠脾脏，研磨制备脾细胞悬液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按比例混合，加入聚乙二醇促融合，生成杂交瘤细胞。在HAT培养基中筛选阳性杂交瘤细胞，进而采用A蛋白进行免疫检测，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆、保存。将阳性杂交瘤细胞进行体外或体内培养，对培养液或腹水进行分离纯化，得到A蛋白的特异性抗体。