蒋志刚等－保护生物学21第15章 濒危动物的非损伤性DNA检测.pdfVIP

第 15 章 濒危动物的非损伤性 DNA 检测 传统的遗传多样性检测方法常常都要求新鲜或冷冻的血液或组织样品 这不可避免地会 惊动动物或对动物造成伤害 尤其是当我们对野生和濒危动物群体进行遗传学研究时 取样 上困难较大 非损伤性 DNA 检测技术靠收集一些自然脱落的毛发等材料进行遗传学分析 这种方法不惊动动物 而且毛发能在室温下保存相当长的时间 这就使得我们对野生和濒危 动物的遗传学研究成为可能 因此这一技术的出现为遗传多样性和保护遗传学研究注入了新 的活力 15.1 非损伤性 DNA 检测方法简介 非损伤性 DNA 检测技术利用动物陈旧标本 遗骸 毛发 分泌物或排泄物等提取微量 DNA 通过多聚酶链式反应 PCR 扩增出大量目标 DNA 进行遗传变异分析 非损伤性 DNA 检测方法可分为以下几个步骤 收集实验材料 微量 DNA 提取 PCR 扩增反应 DNA 多态性分析 目前 非损伤性分析方法已在若干大型珍稀 濒危动物的保护遗传学研究 中得到应用 Morin 等 1994 Zhang 等 1994 我国在这方面的研究也已开始起步 例如 我们已采用这种非损伤性 DNA 检测技术对大熊猫 小熊猫 金丝猴 中国黑冠长臂猿 亚 洲黑熊等的线粒体 DNA D-环区 细胞色素 b 基因等 DNA 片段进行了序列分析 宿兵等 1995 张亚平 1993 1994 另外 我们还鉴定出了大熊猫的 10 个微卫星 DNA 座位 并成 功地进行了大熊猫的亲子鉴定 张亚平等 1995 15.2 若干濒危动物的非损伤性 DNA 检测 非损伤性技术使保护遗传学的研究手段产生了革命性的突破 我们实验室自从掌握该技 术以来已完成了一些工作 15.2.1 中国黑冠长臂猿的 DNA 检测 我们收集了代表中国黑冠长臂猿 5 个不同类群 11 个个体的新鲜毛发样品和旧皮张样品 已存放 8 30 年 进行检测 我们首先进行线粒体 DNA 控制区片段 PCR 扩增和序列分析 本实验中 PCR 扩增的目标 片段为长臂猿线粒体 DNA 控制区中的约 200bp 的一段 扩增引物为长臂猿线粒体 DNA 控制 区特异引物 _____________________________ 本章作者 吴春花 宿兵 张亚平 D182 5 AAC ACA ACA TGC TTA CAA GC 3 D380 5 GTT GGT GAT TTC ACG GAG GA 3 每一样品的扩增体积为 25 l 内含 10mmol Tris pH8.3 50mmol KCl 0.01 Triton xl00 1.5 mmol MgCl2 0.2 mmol dNTP 1.2 mol 的引物 1.0 unit Taq 酶以及 10 l 模板 溶液 扩增条件为 92 下 3 分钟 接下来进行 40 个循环 55 1 分钟 74 30 秒钟 94 30 秒钟 最后在 72 保温 5 分钟 扩增得到的 PCR 产物经用 GenecleanII 试剂盒提纯后 即直接作为序列分析的模板 序列分析仪为手动式 以放射性同位素 S35-dATP 作为标记物 序列分析引物为 D182 采用美国 USB 公司的 Sequenase 2.0 测序试剂盒 最后采用 PAUP3.1.1 和 PHYLIIP3.51a 数据处理软件对所得到的 DNA 一级序列数据进行聚类分析 通过比较 DNA 序列得知 黑冠长臂猿群体中存在着丰富的序列变异 我们用最大简约 法和最大似然法构建了长臂猿的分子系统树 为形态学研究报道的中国黑冠长臂猿 3 个新亚 种提供了新的证据 同时 针对该类珍稀动物的保护 提出将上述的长臂猿的种和亚种作为 不同的进化显著性单元 Evolutionarilly Significant Units 简称 ESU 进行保护和管理 以保 护各类群在进化史中积累的遗传变异及其进化潜力 15.2.2 大熊猫的父系鉴定 大熊猫 Ailuropoda melanoleuca 是世界上最濒危和最受欢迎的动物之一 其数量仅 1000 只左右 它的保护受到了我国及国际社会的广泛重视 OBrien 等 1994 目前 约有 100 多 只大熊猫饲养于动物园中 在繁殖季节 为了最大限度地增加母猫的受孕机会 常采用一母 多雄 自然交配与人工授精并行等繁殖方式 伴随而至的问题是 由此产生的大熊猫有时具 有 2 3 个有待确定的可能父亲 赵庆国 范志勇 1993 为了评估自然交配与人工授精的 相对成功率 确定生殖能力强盛的雄性熊猫以及计算圈养群体中的起源基因数 需要鉴定这 些未知的父子关系 Kleimant