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ABM 热水提取物对小鼠抗体生成细胞的作用 A.Nakajimaa, T.Ishidaa, M.Kogaa, T.Takeuchib, O.Mazadac, M.Takeuchia* a 603-8555 京都市北区上贺茂本山京都产业大学工程学院生物技术系 b日本鹿儿岛鹿儿岛大学医学院保健学系 c日本东京京都府立医科大学微生物系 摘要：通过对绵羊红细胞（SRBC）抗原反应形成的溶血性空斑细胞（PFC）试验来检测 ABM 提取物对抗体生成的影 响，进一步验证 ABM 水提物的免疫增强作用。腹腔注射 25mg/kg 的 ABM，我们发现小鼠脾脏中的 PFC 数量明显高于 对照组（p0.01），Mac-1 或 CD25 阳性细胞数量也有明显的增加（p0.01,p0.001）。但是 ABM 试验组与对照组相比， CD19 阳性细胞数量并没有明显差异。无论是在脾细胞还是腹膜巨噬细胞中，ABM 将增强 IL-6 和IL-1β 的 mRNA 的表 达。这个结论表明 ABM 可能是有效的刺激因子，刺激 T 细胞和巨噬细胞释放 IL-6 和IL-1β，从而加强了与 SRBC 抗原 反应的抗体的生成。 1 引言 由于化疗药物和一些合成的化合物在抗肿瘤的同时也具有巨大的副作用，因此人们开始对一些无副作用且具有活性成 分尤其是抗肿瘤活性的天然物质非常关注。目前，各种蘑菇被用作免疫增强剂，从蘑菇中分离出来的许多多糖和肽都 有抗肿瘤的活性。如黑木耳，猴头菇，龟裂马勃。当然巴西蘑菇（ABM）也被报道有抗肿瘤的活性。在皮耶达德，一个 坐落在巴西圣保罗的郊区，ABM 在那里是作为传统的药物。ABM 的多糖成分有抗肿瘤的活性能抵抗 Sacoma180，多 糖的结构包括 β-1，6-吡喃葡聚糖残基。ABM 提取物主要包括（1-4）-α-D-葡聚糖和（1-6）-β 分支，它通过介导自然 杀伤细胞的活性和细胞凋亡来杀死肿瘤细胞。ABM 的肽葡聚糖对于 Meth A 肿瘤细胞有直接的细胞毒作用，对于小鼠 荷瘤有间接的免疫增强的作用。在用巴西蘑菇处理过的小鼠中，我们发现 ABM 多糖能改变 T 细胞亚群中脾脏 Thy1,2-，L3 T4 阳性细胞的百分比。这些报告表明，ABM 多糖通过免疫调节对肿瘤细胞产生细胞毒作用。尽管许多报 道指出很多天然物质特别是 ABM，拥有肿瘤杀伤活性，但是关于延迟型超敏反应或抗体反应的免疫增强作用很少被 报道，我们尚不清楚ABM 提取物如何激活免疫系统,也没有相关报道证明 ABM 有增强抗体产生的功效。因此，本文主 要对巴西蘑菇是否可以诱导抗体产生及产生的机理进行研究。 2 材料和方法 2.1 小鼠 C57BL/6品系的雌小鼠（8-10周大）。小鼠由日本（SLC）提供，12只小鼠进行实验。根据Kyoto Sangyo 大学动物委员 会伦理标准对小鼠进行处理。 2.2 ABM 的制备 ABM 的沸水提取物来自 Kyoto Engineering。ABM 提取物根据Mizuno et al.方法提取。用沸水对 ABM干体进行提取，提 取物在 1800×g离心 10分钟，冻干，再用浓度为10mg/ml的含有自由离子 Ca2+和 Mg2+ Dulbecco’s PBS缓冲液中重新 溶解，再通过 0.45um滤膜进行过滤。40C保存备用。 2.3 溶血空斑试验 绵羊的红细胞（SRBC）用做抗原（Nikken 生化实验室）。SRBC用盐水洗涤三次。小鼠同时腹腔注射 1×108个 SRBC和 ABM提取物（25mg/kg），对照组用 PBS。4天后，取出小鼠的脾脏，脾细胞在 490×g离心5分钟离心2次，在10 ml的 Eagle‘s MEM中重新悬浮。台盼蓝染色排除试验检测存活细胞。通过 Cunning-ham 和 Szenberg 方法确定与 SRBC 抗 原反应的每 10 6脾细胞或脾中的 PFC 数量。100ul 脾细胞悬浮液中加入 50ul50%的 SRBC和 24%的补体使终体积达到 500ul。取 100ul样品在 370 C下（Cunningham’s chamber）中温育 1 小时通过菌落计数器对 SRBC 的溶血空斑进行 计数。 2.4 IL-1β 和 IL-6 mRNA 的表达 （1） RNA的提取。（a） 脾细胞.用 ABM提取物或 PBS对小鼠进行腹腔注射。4天后 ，取出脾脏，用钢丝网剁碎，过纱 布层。通过（AGPC）方法提取脾细胞的所有 RNA。（b）腹膜细胞.巨噬细胞培养基用10ml的 PBS灌胃收集的腹腔渗透液 制成。把渗出液注入塑料试管，在 250×g下离心 10分钟。颗粒状渗出细胞在加入 10%的 FCS的 RPMI中再次悬浮。等量 的腹膜细胞放入 96-well的培养皿（5×105cell/0.1ml/well