生物通WesternBlot技术专辑之PAGE胶电泳及转膜.doc

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Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜 ??? PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了,除了顺手的工具能防止漏胶,PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响,这个配胶的比例,在《分子克隆》上有详细的论述,相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵(AP)一定要新鲜——最好用小指管配AP(写日期)保存在-20度,超过2周的AP扔掉算了,或者已经反复打开使用多次的AP都别用,小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽(或者混合不匀),因为相对配胶的其他组分,AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错,那绝对是你自己找骂,不值得同情。水要用去离子的纯水,MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液,很贵,也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶,条带清晰漂亮,可惜一直没有搞清楚配方的奥秘;但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步,不过,对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶,各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择,打开即用,当然更直接方便,更吸引人的是结果漂亮,分辨率高,特别是重复性好,条带真正是razor sharp啊!平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊,实验紧凑又轻松,效率也更高啊!如果实验都能这么“好马配好鞍”,想必更容易出结果,也就更容易拿经费吧!什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊!Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex(原来的FMC)PAGEr都是首选预制胶。可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了,偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动,买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移,面对这种诱惑,你难道就没有一点非份之想的冲动? 上样电泳:上样前蛋白样品最好离心,上样量不宜过多,以免看结果时,每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作,按照说明控制电流,不要过多重复使用电泳Buffer(别小气,重复使用会降低缓冲能力的),好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你,你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处,OK,电泳结束了。 电泳结果检查:如果要做Western Blot,是否需要先检查电泳结果呢?能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速,可以分辨1ug左右的条带,是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多,可以分辨2-5ng蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合,会干扰后面的Western Blot实验,很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶,一块染色一块转膜,一般也可以说明问题。如果想在转膜前看看电泳结果,你需要用SYPRO Tangerine——这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高——检测4ng-8ng蛋白,接近银染,但使用非常简单,最重要的是由于不用酸碱或者有机溶剂固定,不干扰蛋白活性,特别适合Western转膜前的染色,或者非变性胶的活性蛋白的检测(比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等)。可惜SYPRO Tangerine价格挺贵的,500ul(5000x)要2000元,即使很节约的用只够大概100多次呢。所以最经济实惠的方法是:丽春红S,直接染色转移膜,检测转膜效果,充分脱色后不干扰Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。 转膜:经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜上固定,才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色,而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散,转移要尽快进行转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作画一样,不光要有好的画笔和颜料,适合的画布也是相当之重要。Western Blotting亦是如此,没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此,选择适合的转移膜,要让转移“膜”高一尺,帮衬而不是阻碍到我们的实验。 ??? Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Blotting Membranes,NC)和PVDF膜(Polyvinylidene-Fluoride) ,此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢?选择的根据主要有:a.膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量),以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小);b.不影响后续的显色检测(也就是适和用于所选的显色方法,信噪比好);c.如果后继实验有其他要求,比如要做蛋白测序或者质谱分析,还要

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