1-EPO的药理作用.docVIP

实验一 重组人EPO的药理作用和体内活性测定 （网织红细胞法）（26组一次实验量） 促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种强有力的造血生长因子，专一性地刺激红祖细胞系细胞的增殖，形成成熟的红细胞集落。EPO主要由肾小管内皮细胞合成并分泌到循环系统。肝脏中kuppfer细胞和骨髓中巨噬细胞也能产生EPO。EPO的分泌受组织内氧分压的调节。 EPO是一种由肾脏分泌的重要激素，在病理状态下，与多种贫血尤其与终末期肾脏病贫血密切相关。在生理情况下，它能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟。 1985年美国有两家公司同时报道了人EPO基因的克隆，重组人促红细胞生成素（Recombinant Human Erythropoietin，rhEPO）是通过基因工程克隆人的EPO基因，在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞高效表达，经细胞培养，分离和高度纯化后制成的液体制剂或冻干制剂，它具有与人体内分离、纯化的天然红细胞生成素相同的结构和生物学特性。1991年美国FDA已正式批准上市，成为在临床上治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血的最畅销新药。美国2000年EPO的年销售额超过30亿美元。我国的rhEPO已于1995年开始进行临床验证。 【实验目的】 掌握促红细胞生成素的药理作用。 掌握用网织红细胞法对促红细胞生成素的体内活性进行测定的实验操作。 【实验原理】 给小鼠注射EPO，造成体内高EPO状态，EPO促进骨髓内干细胞加速分化为原始红细胞，促进有核红细胞的有丝分裂，促其加速成熟，促进血红蛋白的合成，以及促进骨髓内网织红细胞和成熟红细胞的释放，小鼠外周血中不仅红细胞增多，而且还出现大量的网织红细胞，甚至有核红细胞。因此，可以根据已知不同剂量的EPO与外周血网织红细胞数量的关系曲线来定量测定样品EPO的体内生物学活性。 网织红细胞无细胞核，基质中含有未成熟红细胞基质的核糖体、线粒体及其它成分，这些物质形态不一，可为网状、细小点状或线状，被煌焦油蓝染成蓝色或浅蓝色，这一特点可与其它细胞相区别。 【实验试剂、材料和仪器】 1.实验试剂 （1）稀释液 含0.1％牛血清白蛋白（BSA）的生理盐水溶液（100ml）。（需配制） （2）EPO标准品（3000 U/mL）。（有） （3）EPO样品 用稀释液（1）稀释成40 U/mL和100U/mL 两个不同浓度的样品。（需配制） （4）瑞氏染液 瑞氏染料1g，加无水甲醇600mL，充分研磨使染料完全溶解，过滤，倒入棕色试剂瓶内，置室温下放置1个月后备用。（有，微生物室借） （5）煌焦油蓝生理盐水溶液 煌焦油蓝1g，置研钵中研碎，柠檬酸钠0.4 g，溶于100mL生理盐水中，过滤后储存于棕色试剂瓶中，置室温下放置一个月后备用。（有，李仲娟处借） （6）磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.8） 磷酸二氢钾0.3g，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）0.2g，加蒸馏水至1000mL，调pH值至6.8。（需配制） （7）肝素抗凝剂。（需配制） （8）5％苦味酸。（需配制） 2.实验材料 （1）动物 清洁级昆明小鼠，6～8周龄。（需准备，空白20只注射生理盐水，40只注射EPO40 U/mL，40只注射EPO100 U/mL，均连续注射一周） （2）1mL注射器20支（自备） （3）棉签若干（自备） （4）载玻片3盒、推片15片（自备） （5）香柏油（显微镜室有） （6）生理盐水 3. 实验仪器 显微镜。（借用显微镜室） 【实验步骤】 1. 实验动物分组，用5％苦味酸作标记。小鼠分为3组：对照组、低剂量组、高剂量组；每组共3只小鼠。 2. 注射：皮下注射，0.1mL/只，连续5天。 第五天（实验当日）摘小鼠眼球采血，用肝素抗凝，抗凝血置于1.5mLEP管中。 4. 用煌焦油蓝染色。另取干净1.5mLEP管一只，加入煌焦油蓝生理盐水溶液2～3滴，然后加入等量的血液。混匀后放置15～20分钟，使红细胞充分染色。 5. 用少许染色好的血液作血涂片。取绿豆大小血滴，用清洁载玻片的一端轻轻接触血滴，使血滴附于玻片面上， 以左手拿该片的两端，迅速用右手拿住另一载玻片的一端，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两载玻片约成45度角度，轻轻移动，使血滴成一直线，然后由前向后推为一均匀的薄片。 6. 干燥后用瑞氏染液复染。 涂片在空气中干燥后置于染色架上，滴加瑞氏染色液，使涂片被染色液覆盖，染1分钟后，再加等量的缓冲液于染色液上，浸染约5~8分钟。此时涂片表面呈现一层古铜色，用蒸馏水迅速冲洗，见涂片呈粉红色后，以吸水纸吸干。 图3－1 血涂片的制作 7. 在低倍镜下选择细胞分布均匀，着色清晰的部位，用油镜计数20个视野内的红细胞数和网织红细胞数，计算网织红细胞数对红细胞数的比值（R）。 【实验数据处理】 按