DNA固相合成.doc

应用固相合成法合成下列碱基顺序的DNA：5-GCCTAACGTAAC-3。 DNA化学合成时由3端向5进行。 合成原理步骤如下： 脱保护基 用三氯乙酸脱去预先连接在CPG上的核苷酸的保护基团DMT（二甲氧基三苯甲基），获得游离的5-羟基端，以供下一步合成反应。 活化 将质子化的核苷3-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入合成柱，形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体（其5端仍受DMT保护，3端被活化）。 连接 二步中活化得到的中间体遇到一步中脱保护基的核苷酸，与核苷酸的5-羟基发生亲核反应，缩合并且脱去四唑，此时合成的寡糖核苷酸链向前延长一个碱基。 氧化 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酸酯键与连接在CPG上的寡糖核苷连接，而亚磷酸酯键不稳定、易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三脂，得到稳定的寡糖核苷酸。 经过上述几个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连接到CPG的核苷酸上，再采取上述同样的步骤，即可得到一DNA片段样品。最后对其进行切割和脱保护基(一般对A、C碱基使用苯甲酰基保护；G碱基采用异丁酰基保护；T碱基则不必保护；亚磷酸用腈乙基保护）。具体则是用苯硫酚除去5-OH上的保护剂DMT，用浓氢氧化铵将DNA片段与固相树脂断开，使DNA得以洗脱下来。再用浓氢氧化铵在加热条件下使碱基上的保护剂除去，最后除去氢氧化铵，在真空中抽干。 DNA纯化分离 利用HPLC或者PAGE对得到的粗品进行纯化分离，得到所需的DNA分子。 DNA序列鉴定 检定D N A 片段的顺序的方法主要有两种: (1)wandering SPot方法，主要适用于适用于寡核苷长度在20个碱基以下的片段；（2）化学裂解法，该法核苷酸碱基顺序从凝胶的放射自显影图谱上直接读出，但对于合成产物中少量的不纯物是检测不出来的； 具体步骤： 各种基团的保护方分别如下图所示： （1）戊糖的保护 （2)碱基的保护 在本题中保护后的碱基A、C、G分别简记为Ba、Bc、Bg、Bt。因为T无需保护，为书写方便简记为Bt。 （3）磷酸酯基的保护： 具体合成步骤如下： 如此不断重复，最后得到一条DNA分子的长链，其结构如下： 得到粗产物后再利用电泳或者HPCL技术加以分离，回收片段最长的。 DNA的鉴定 经分离纯化后的DNA寡核苷酸片段,应对其质量(包括长度和核苷酸顺序)进行检定。检定DNA片段的顺序的方法:采用wandering SPot方法，适用于寡核苷酸长度在20个碱基以下的片段。寡核苷酸片段5一端经[γ一32P]-ATP用T4多核苷酸激酶标记后,经蛇毒磷酸二醋酶进行部分水解,标记混合物于pH=3.5的条件下在醋酸纤维纸上进行电泳,然后在DEAE一纤维素板上进行同系层析,寡核苷酸的顺序通过这一标记消化产物的特定迁移率来测定。此方法的好处在于不仅可测出寡核苷酸的顺序,也可以检出不纯物的污染。 参考文献： 1.生物化学教材，古练权，高等教育出版社 2.DNA的化学合成及其应用，静国忠，生物化学与生物物理进展，1986.4 3.DNA的化学合成，戚志红、陈常庆，(中国科学院上海生物化学研究所)，专论与综述