1、研究动机与研究问题.doc

Abstract 由於 T-bet 已經被證實可調控IFN-? 的啟動子，因此被認為會與pIFN-?結合(3)，初期實驗是想利用轉錄因子：T-bet和IFN-? 啟動子的作用來探討 Yeast one hybrid 的系統是否可以偵測到兩者的作用。若可行，IFN-? 啟動子作用的基因，與研究這些基因的產物是否可以促進T細胞從 Th 0 細胞分化到 Th1 細胞。Introduction 人體的免疫反應可分為細胞調節的免疫反應（Cellular immunity）及體液調節的免疫反應（Humoral immunity），T細胞扮演重要的角色。T細胞在胸腺發育後經過正選及負選（Positive and negative selection）而成熟，然後這些成熟的 T細胞會從胸腺轉移到周圍的組織。在接受抗原(Antigen)的刺激後，原始的輔助性 T 細胞 （Native CD4+ T helper cells；Th0）會因不同的細胞激素（Cytokine）刺激而分化成不同的輔助性T細胞（例如Th1 和 Th2），Th1細胞會分泌第二型干擾素（IFN?）IL-2），淋巴毒素（LT）和癌細胞死亡因子（TNF-? 和 TNF-?）。這些細胞激素可調控B細胞及其他類型的免疫細胞，然而，在極不正常的情況之下，這些細胞也可能造成自體免疫的疾病（例如：類風濕性關節炎、結腸炎、糖尿病和實驗性急性腦炎）和發炎的免疫反應。Th2 細胞則會分泌其它白介素4、5、10和13，(1)。（參見圖一） T細胞從未受刺激的Th0細胞發展到 Th1細胞的分化過程中，Interferon gamma promoter；pIFN-??）會被活化而導致IFN-? 的產生。。：，IFN-??的表現。T-betTbx21，Tbt1或TBLym）是由530個氨基酸所組成的轉錄因子，它具有T-box DNA結合區（T-box DNA binding domain）可與基因啟動子上的T-box序列（consensus T-box site; aatttcacacctaggtgtgaaatt）結合(2-4)。為了找出可使 T細胞由 Th0發展到 Th1 的分子，因此我們實驗室想要利用Yeast one hybrid 的系統(5)來找尋能與IFN-? promoter 序列結合的蛋白質。Yeast one hybrid 系統的原理如圖二： Materials and Methods 構築含有第二型干擾素啟動子的質體（pIFN-?/pLacZ）：（圖三） ( 設計合適的Primers，利用PCR技術來釣出Genomic DNA 內的第二型干擾素啟動子。 pIFN-? 5’primer：5’gga ctt cct cac caa att gtt c3’ pIFN-? 3’primer：5’cct tta gac tcc ttg ggt cct t3’ ( 將IFN-? promoter 嵌入pLacZi載體（或pHISi、pHISi-1）之中。 選擇適當的限制酵素將載體直線化後，再利用接合酵素將PCR產物連接起來，然後根據pLacZi載體上帶有的Ampicillin抗生素篩選指標來作篩選。 (2) 將帶有報導基因和IFN-? promoter的核酸序列嵌入酵母菌的染色體：（圖四） ( 將pIFN-?/pLacZ質體直線化（Linearization）： 用適當的限制酵素（Restriction enzyme）將質體直線化。 pLacZi : Nco I 或 Apa I ( 轉形作用（Transformation）： 利用轉形作用將直線化的pIFN-?/pLacZ核酸序列嵌入酵母菌YM4271染色體中，並將之培養在適當的酵母菌篩選培養基上。 pLacZi : SD/-Ura 培養基。 ( 篩選帶有嵌入基因片段的酵母菌株： 根據酵母菌是否帶有嵌入報導基因的表現，然後在適當的篩選培養基中生長。若有，則表示此酵母菌株帶有嵌入的報導基因;反之，則無。 (3) 構築含 T-bet 和 GAL4 AD 的載體（T-bet BD/GAL4 AD）（圖五） 由於載體pGAD424上含有轉錄作用的活化區(Activation domain; AD)，而 T-bet 是已知的轉錄因子，因此將其DNA-binding domain(BD)與pGAD424 的AD 接合在一起，以產生帶有BD-AD的融合蛋白質以活化pIFN-? 下游的報導基因LacZ （?-galactosidase）。 ( 設計合適的Primers，利用RT-PCR技術將 T-bet 的DNA 結合區 (DNA-binding domain)核酸序列釣出。 T-bet BD 5’primer: