第二章 实验技术02 - 细胞生物学在线.pptVIP

第二章细胞生物学实验技术;;;;（一）普通光学显微镜;Structure of Microscope;Light Pathway of Microscope ;3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨力 R=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长； N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2； n=介质折射率； α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。;表一、几种介质的折射率;显微镜的几个光学特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好； sin α /2的最大值小于1；镜口率最大约1.6； 普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。;（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope;Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green;（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM;laser confocal scanning microscope, LCSM;;LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue) /;（四）暗视野显微镜 dark field microscope;（五）相差显微镜;原理;用途：观察未经染色的玻片标本。;（六）偏光显微镜polarizing microscope;（七）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）;（八）倒置显微镜 inverse microscope ;（九）当代显微镜的发展趋势;二、电子显微镜;1. 原理;表二、不同光线的波长;TEM LIGHT PATHWAY;TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM;2. 制样技术;2）负染技术;3）冰冻蚀刻 freeze-etching;an onion root tip cell with no etching.;;（二）扫描电子显微镜;Scanning electron microscope（ SEM）;工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。;SEM LIGHT PATHWAY;人类红细胞;酵母;人类精子;（三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM;扫描隧道显微镜原理;STM image of a DNA molecule;Schematic drawing of AFM;三、显微操作技术micromanipulation technique;显微操作仪;;第二节 生物化学与分子生物学技术;组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空气干燥、冷冻干燥。 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。;（二）显示方法;二、免疫细胞化学 immunocytochemistry;三、放射自显影术;四、分子杂交技术;人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 ;（二）Southern杂交;六、PCR 技术;PCR原理;第三节 细胞分离技术;一、离心技术;（一）差速离心 Differential centrifugation;Low speed;（二）密度梯度离心;1. 速度沉降 velocity sedimentation ;2.等密度沉降 isopycnic sedimentation;Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation;二、流式细胞术;三、细胞电泳;第四节 细胞培养与细胞杂交;（一）动物细胞培养;;原代培养 （primary culture）：即：培养来自动物机体的细胞群。将细胞转移到新的容器中培养称为传代或传代培养（passage），每代细胞分裂约3-6次。 细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。 细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有