方六荣《动物病毒学》第七章 病毒的检测.docVIP

第七章 病毒的检测 一、病毒的分离鉴定 病料的采集 病料采集后的保存 病毒材料的处理 病毒材料的接种 组织培养细胞中病毒增殖的判定 病毒感染力的滴定 病毒理化学特性的测定 （一）病料采集的基本原则 尽量无菌操作，避免细菌污染 尽早采集病料，尽快送检，低温运输 根据动物及病毒的种类不同采集不同的组织病料 同一疾病，不同病程取不同标本 检材容器贴上标签，并在相应化验单详细填写检验目的、标本种类、临床诊断及其他常规项目 （二）病料采集后的保存 采集病料后应尽快冷藏保存 -30℃可保存几个月，-70℃可保存几年 怀疑为疱疹病毒的感染材料，可置-50℃以下温度或4℃保存 现场采集病料，应尽快置冰—盐混合的冰瓶内，送往实验室或冷藏地点。 （三）病毒材料的处理 1. 脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉等器官或组织 充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含青霉素、链霉素各200U/ml），反复冻融3次。2000r/min离心 10min，取上清作接种物。 幻灯片6 2. 鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物 用内含1000u/ml青、链霉素（P.S）的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，2000r/min 10min取上清作接种物。 幻灯片7 3. 咽喉拭子或鼻拭子 用棉拭子擦拭咽喉部或鼻部，并迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液（200-500u/ml P.S）的试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000r/min 10min，收集上清作接种物。 幻灯片8 4. 粪便 用棉拭子插入肛门沾取或扑杀病畜后由肠管采集。用含1000u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀释，4℃感作4h，2000r/min 10min取上清作接种物。 5. 无菌的体液或鸡胚液 直接作接种用 （四）病毒材料的接种 1. 本动物 2. 实验动物 3. 鸡胚 4. 组织培养细胞 1. 本动物 马传贫病毒、猪瘟病毒、鸡瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒 2. 实验动物 3. 鸡胚 正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、脑炎病毒 4. 组织培养细胞 （五）组织培养细胞中病毒增殖的判定 1. 细胞病变（cytopathic effect, CPE） 腺病毒：细胞肿大、颗粒增多、病变细胞呈葡萄串状。 伪狂犬病毒：细胞圆缩、脱落、裂解，形成合胞体。 正常的Marc-145细胞 病变的Marc-145细胞 幻灯片13 A：正常PK-15 B、C、D：感染PRV的PK-15 幻灯片14 口蹄疫病毒在BHK-21细胞上的病变 幻灯片15 2. 细胞代谢的测定 细胞正常，营养液pH下降 大多数病毒感染后，营养液pH下降不明显或上升。 少数病毒感染后，营养液pH下降（腺病毒、PRRSV) 3. 抗原的测定 间接免疫荧光(immunofluorescence) SDS western blot 4. 中和试验 7. 电子显微镜观察 8. PCR扩增 9. 实验动物或鸡胚接种 （六）病毒感染力的滴定 半数致死量（50% lethal dose, LD50） 半数感染量（50% infective dose, ID50） 鸡胚半数感染量（50% egg infective dose, EID50） 组织培养半数感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50) 蚀斑形成单位(plaque forming unit, PFU） （七）病毒理化学特性的测定 病毒核酸型鉴定 脂溶剂敏感性试验 胰蛋白酶敏感试验 耐酸性试验 耐热性试验 病毒粒子大小的测定 病毒对理化因子敏感的判定标准：试验组的TCID50比对照组低2个对数以上判为阳性。 试验组 对照组 TCID50/0.1mL 10-2 10-5 幻灯片20 1、病毒核酸型鉴定（药物抑制试验） FUDR、IUDR、BrUDR（5-溴脱氧尿苷） 原理：FUDR、IUDR、BrUDR是嘧啶的卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶，产生无功能分子，从而抑制DNA的合成。常用浓度为50ug/ml。 2、脂溶剂敏感性试验 （1）乙醚敏感试验 用终浓度为20%的乙醚处理病毒（4℃内作用24h），离心取病毒液；同时设对照。滴定两组病毒的TCID50。 （2）氯仿敏感性试验 用终浓度为4.8%的分析纯氯仿处理病毒（4℃振荡混合10min）。随后离心取病毒液。同时设对照。测定两组病毒的TCID50 3、胰蛋白酶敏感试验 脊髓灰质炎病毒、猪传染