202凝膠过滤层析.pptVIP

实验十 凝胶过滤柱层析纯化碱性磷酸酶;一、目的要求;本次实验安排 部分操作步骤介绍 分组，各组装柱、平衡 继续介绍原理、步骤及仪器的使用 各组上样、分离蛋白质（仪器调节好后，可以离开吃饭，各组留一个同学观察） 吃完饭收集样品，测定酶活力，整理玻璃仪器，结束实验。 ;二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。;AGAROSE琼脂糖凝胶;1. Spherical particles packed into a column;;Steric exclusion leads to early elution;内水体积Vi 外水体积Vo 柱床体积Vt 洗脱体积Ve Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi ;;Kd=0 Kd=1 0Kd1 Kd1 ;;优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 Superdex:葡聚糖和琼脂糖交联而成;离子交换纤维素柱色谱 (1)原理： 不同蛋白质由于等电点不同，在同一pH介质中所带的电荷种类数量不同，因而与离子交换剂的亲和力不同。 (2)类型： 阳离子交换剂：羧甲基纤维素(CM-纤维素) 阴离子交换剂：二乙氨基乙基纤维素(DEAE-纤维素) (3)基本方法：交换剂改型，上样，淋洗，洗脱，收集 ;;凝胶及柱的选择; ;装柱的两种方法： a.手工操作 1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法 ;样品上柱 分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的5—10% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 ;应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定;三、操作方法;（二）装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出（此步不做）。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约2-3cm高度柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm（或5min）后，打开柱的出口，调节合适的??速（0.5 mL/min）左右，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约2-3cm左右时停止装柱，关闭出水口。;;（四）加样 1.进一步调节好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪。 2.关闭柱子出水口，打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿层析柱壁将碱性磷酸酶样品溶液1.5mL左右小心加到凝胶床面上，应避免将柱床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁1次。最后凝胶上方加满洗脱液，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通洗脱瓶。上样和洗脱的流速为0.3mL/min左右。 （五）洗脱 洗脱时，打开上、下进出水口夹子，用0.01mol/LTris-HCl洗脱，用自动部分收集器收集流出液，每管2mL 。;;(六）碱性磷酸酶活力峰收集 1.对部分收集器收集的洗脱液进行碱性磷酸酶活力测定，结合核酸蛋白检测仪检测的OD280蛋白质吸收峰曲线，做出碱性磷酸酶的洗脱图谱，收集碱性磷酸酶活力峰（活力最高的那管酶冻起来，作为电泳的样品），即为经凝胶过滤柱层析纯化的洗脱液。 2.对合并后的碱性磷酸酶活力峰进行酶活和蛋白浓度的测定，即可得到其比活力（这步不做）。 （七）将柱子拆下，凝胶回收，核酸蛋白检测仪的石英杯用蒸馏水冲洗干净。 ;;四、仪器的使用－核酸蛋白检测仪及部分收集器的操作方法 ;核酸蛋白检测仪操作方法(预热10-20min);有纸记录仪操作方法;无纸记录仪使用说明;部分收集器的操作方法;2．定位， 将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。 ;新BSZ160自动部分收集器;;核酸蛋白检测仪及记录仪（正面）;核酸蛋白检测仪及记录仪（背面）;核酸蛋白检测仪;记录仪;部分收集器;;改进型BSZ160自动部分收集器;五、注意事项 1）各