免疫組化与原位杂交.pptVIP

免疫组织化学和原位杂交 Immunohistochemistry In situ hybridization; 免疫组织化学 前提条件：所使用的抗体必须能用于免疫组化。 一、基本原理 ： 利用 抗体（antibody）与 相应抗原（antigen）的特 异性结合, 通过与抗体连接 的酶反应或荧光染料显示 抗原所在的位置。 ;二、常用于标记抗体的标记物 一）酶（enzyme） 1.辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP） 辣根过氧化物酶的作用物（底物，substrate） 1）二氨基联苯胺（3,3-diaminobenzidine，DAB） 显色特点： --- 棕色 ---不溶于水及脂类溶剂（酒精 ethanol, 二甲苯xylene） ---不扩散 ---永久保存 2）3氨基9乙基卡巴唑（3-Amino-9-Ethylcarbazole，AEC）; 显色特点： ---棕红色 ---不溶于水，但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存 3）4氯1萘酚（4-Chloro-1-naphthol，CN） 显色特点： ---蓝色 ---不溶于水，但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存 4）四甲基联苯胺（3,3‘,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB） 显色特点： ---深蓝色; ---不溶于水及脂类溶剂 ---不扩散 ---永久保存 2.碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP） 碱性磷酸酶的作用物（底物，substrate） 1）四唑淡蓝 /5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(Nitro-Blue- Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlyl- phosphate, NBT/BCIP） 显色特点： ---紫色 ---不溶于水但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存 ;2）快红（固红/萘酚磷酸盐，Fast Red TR/Naphthol AS-MX） 显色特点： ---桃红色 ---不溶于水但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存 3）快蓝（固蓝BB/萘酚磷酸盐，Fast Blue BB/Naphthol AS-MX) 显色特点： ---蓝色 ---不溶于水但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存 4）品红（品红/萘酚磷酸盐，Fuchsin/Naphthol AS-TR） ; 显色特点： ---红色 ---不溶于水及脂类溶剂 ---不扩散 ---永久保存;二）荧光染料（fluorescent dye）; 常用的荧光染料 1.异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）;3.羰花青类（carbocyanine dyes);吸收光波及发射光波长范围广，也是目前应用最广泛的荧光素。;三）生物素(维生素H, Biotin ) 水溶性维生素，属于维生素B族。相对分子量244， 分子结构简单，通过其羧基与被标记物的氨基结 合，可标记抗体、酶、激素、核酸、凝集素等， 由于其分子小，不影响被标记物的理化和免疫学 特性。极易于亲和素（Avidin）结合，形成亲和 素-生物素复合物（Avidin-biotin complex,ABC）因此，常与亲 和素一起被用于免疫组化的ABC方法中。 四）胶体金（colloidal gold） 又称金溶胶（gold solution），是指分 散相粒子直径在l—150nm之间的金溶胶， 能稳定又迅速地吸附蛋白质，可以作为 标记物标记抗体、抗原、激素、核酸等， 在药物检测、生物医学等许多领域有广 泛的应用，常用于透射电镜。 ;三、组织标本的制备 一）组织标本的取材 取材原则:尽可能快的切取所需组织浸入固定液或快速冰冻,保持 组织的新鲜以最大限度地防止抗原破坏和降解。 二）固定（Fixation):根据所检测抗原的性质选择适当的固定液 和固定方法，固定液用量应是标本的40倍。 1