生物化学实验一氨基酸聚酰胺薄膜层析DNS-Cl法.docxVIP

实验一 氨基酸聚酰胺薄膜层析DNS-Cl法 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-03-24 同组者：张奕 实验目的 1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定。 2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法。 实验原理 荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯（dansyl-Cl，简称DNS-Cl）在弱碱性条件（pH9.0左右下与氨基酸（肽或蛋白质）的α-氨基结合成带有黄绿色荧光的DNS-氨基酸： 其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来（称为Edman-DNS法）应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH： 在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2： DNS-氨基酸在紫外光照??下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析工作中。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速，从度移动而达到分离的目的。 聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成，又称锦纶66 。因这类物质的分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的—C＝O及NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类（包括黄酮类、鞣质等）和酸类（如核苷酸、氨基酸等）是以羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，决定了吸附能力的差异。在层析过程中，溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。 实验器材 层析缸（10cm×20cm），聚酰胺薄膜（7cm×7cm），电吹风，紫外灯（波长254nm或265nm），移液枪，量筒，吸管。 实验试剂 1.DNS-Cl丙酮：50ml 2.5mg/ml 2.缓冲液：pH9.9 Na2CO3- NaHCO3 3.氨基酸溶液：丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、混合氨基酸 4.展层液 甲酸：水=1.5：100（现用现配） 实验步骤 1. DNS-Cl标记： 取4个小离心管，分别加入氨基酸30ul，再各加入30ulDNS-Cl丙酮溶液，混合均匀后置于37℃水浴中1小时。 2. 点样： 在距聚酰胺薄膜底端0.5-1cm处用铅笔画一条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过2mm，重复2-3次，每次点完用电吹风冷风吹干，最多不宜超过5次； 3. 展层： 1) 配制展层液100ml，V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100。 2) 将展层液置于培养皿盖（加12-13ml）或底（加10ml）中，将已点样的聚酰胺薄膜光面向外用皮筋套成圆柱形，并使其两端不接触，之后放入展层液中，盖上500ml烧杯。 3) 待展层液上升到距顶端大约5mm时展层结束，将其取出，冷风吹干。 4. 透射： 将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出，并计算Rf值进行比较。 实验结果 丙氨酸 苯丙氨酸 赖氨酸 混合氨基酸 丙氨酸：Rf=0.55 苯丙氨酸：Rf=0.26 赖氨酸：带1 Rf=0.14，带2 Rf=1 混合氨基酸：带1 Rf=0.14，带2 Rf=0.26，带3 Rf=0.63，带4 Rf=1 因此可以推测，混合氨基酸成分为丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸。 注意事项 1. 在实验操作中应注意不要污染聚酰胺薄膜。用手拿层析薄膜时不能接触无光泽一面，不能使其沾水，以防污染薄膜，造成实验结果不精确。 2. 在薄膜上画直线时，要注意轻画，否则可能会划破薄膜上的纤维，造成在层析时样品一部分无法上行，影响最后实验结果。? 3. 点样时点样时毛细管碰一下薄膜即可，若接触时间过长会使点样的直径过大，点样直径不能超过2mm。点样间的间距控制在1到1.5cm，太近可能会有样品重叠。 4. 点样时还要注意必须吹干后才能进行下一次点样，否则会使点样半径过大，使层析后的最后形状