07 实验七 亲和层析纯化和SDS-PAGE鉴定目的蛋白质(GST、SDS-PAGE).ppt

实验七亲和层析纯化和SDS鉴定目的蛋白质;实验目的;第一部分 GST亲和层析纯化目的蛋白;亲和层析原理;亲和层析原理;GST亲和层析 ;GSH-Sepharose 4B;GSH- Sepharose 4B;GSH-Sepharose 4B;亲和层析流程;第一部分 实验步骤;一、细胞破碎;二、装GSH-Sepharose 4B柱;三、纯化目的蛋白;四、SDS样品制备;;亲和层析试剂;亲和层析试剂;第二部分SDS检测目的蛋白质;实验目的;蛋白质与SDS按1:1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。 在15-200 KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系： logMW=K-bm;; 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同。（电荷效应、分子筛效应） 不连续系统：缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。 （电荷效应、分子筛效应、浓缩效应）;1. 凝胶孔径的不连续性（2种孔径） 2. 缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高。;3. 电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。;实验步骤;12%分离胶;试剂名称;5. 将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液， 轻轻拔掉梳子； 6. 点样：每个样点30 uL，Marker点15 uL； 7. 电泳：100 V，约20 min，样品进入分离胶后，将电 压调到130 V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，停 止电泳；;8. 拆开玻璃板，切除浓缩胶，将分离胶放入塑料盒内，加入染色液，振荡30 min； 9. 回收染色液，加水清洗，用微波炉高火煮 4-5 min，重复2-3次； 10. 观察胶中的蛋白质条带。;;实验试剂;实验结果;SDS试剂;3. 浓缩胶缓冲液（1.0 mol/L Tris-HCl，pH 6.8） Tris 12.1 g，加60 mL蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节pH到6.8，加蒸馏水到100 mL。 4. 10 %（W/V）SDS 5. 10 %（W/V）过硫酸铵（现用现配）;6. 10×电极缓冲液（pH 8.3）：Tris 30.3 g，Gly 144.2 g，SDS 10 g，加水到1000 mL。 （用时稀释10倍） 7. 蛋白质标准溶液：低分子量蛋白质标准，加200 uL水溶解，加50 uL上样缓冲液。;8. 上样缓冲液（5×）：1.0 moL Tris-HCl（pH 6.8）40 mL，甘油40 mL，巯基乙醇20 mL，SDS 8.0 g，溴酚蓝0.005 g，体积100 mL。 9. 染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0 g，250 mL甲醇（乙醇），80 mL冰乙酸，670 mL水 。 10. 脱色液：50 mL甲醇，75 mL冰乙酸，875 mL水。