第2章 生化制药基本技术.pptVIP

第二章 生化制药的基本技术;第一节 原料的选择、处理及有效成分的提取 ; 生物材料、发酵或培养液 ↓ 预处理（清洗、加热、调pH、凝聚、絮凝） ↓ 细胞分离（沉降、离心、过滤） ↓ 细胞 ↓ 细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理） ↓ 收集上清液 ↓ 初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤） ↓ 高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等） ↓ 成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等） 图2-1 生化药物提取的一般工艺流程;一、原料的选取与保存 ;二、生化药物提取;2. 提取的溶剂系统;①液-液提取也即萃取，也是利用溶质在互不相溶的两相中分配系数不同而进行的提取分离的方法。;在一定温度和压力下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中达到平衡后，溶质在这两相的浓度比为一常数K，此常数称为分配系数。 在常温下Ｋ为常数；Ｃ的单位通常用mol/L或质量单位/mL。 ;工业生产中常用的萃取溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。;;②固-液提取也称为浸取。为了高效、快速地从固体中将目的物浸取出来，同时尽可能将杂质留在固体中，选择合适的溶剂很重要，溶剂选择的主要依据是“相似相溶”原理。 浸取常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂和乙醚、氯仿、苯等非极性溶剂。 ;三、细胞破碎技术;1. 机械法：包括球磨法、高压匀浆法、超声破碎法、X-press等。; 珠磨法 bead mill;超声波破碎仪 ;技术;2. 非机械法：酶溶法、化学渗透法、反复冻融法、干燥法等;;四、固液分离;;;第二节 沉淀技术;一、盐析法;;二、有机溶剂沉淀法;三、等电点沉淀法;第三节 色谱技术;一、色谱技术的分类 色谱技术根据流动相的物态不同可以分为气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法。 根据固定相的形状不同，色谱法可分为柱色谱法、纸色谱法和薄层色谱法。 根据分离的机理，可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法和亲和色谱法。 ;二、柱色谱装置和操作;柱色谱操作;慢 中等 快;三、吸附色谱; 混合物中含A、B两个组分，溶解后加至色谱柱中。开始A和B都被吸附在柱的上端，形成原始谱带。当加入洗脱剂冲洗时，A和B将随着向下流动而从吸附剂上洗脱，接着又遇到吸附剂又被吸附，又随着向下流动的洗脱剂冲洗而被洗脱，如此连续不断地被再吸附、再洗脱，经过一段时间的冲洗后，由于A、B的极性不同，在该吸附剂和洗脱剂上被吸附和被洗脱的性能也不同，最终出现A、B两个色谱带。由于A的吸附力小于B，故A 移行较快，在色谱柱下段，而B移行较慢，在柱的上段。继续用溶剂冲洗，A、B将先后被洗脱出来。分别定量收集洗脱液，用TLC跟踪检验，斑点相同的流分A、B两个纯品化合物。 ;在吸附色谱中，溶质在色谱柱中的移动情况常以阻滞因数Rf来表示，是在层析系统中溶质的移动速度和流动相的移动速度之比。 Rf =溶质的移动速度/流动相的移动速度之比 =溶质的移动距离/流动相的移动距离之比;四、凝胶过滤色谱;2. 凝胶的种类和性质;3. 凝胶色谱的应用;五、离子交换色谱;;;六、亲和色谱;薄层色谱原理2;纸层析原理;第四节 结晶;结晶的过程;二、结晶的过程;2. 晶核的形成;3. 晶体的生长;三、晶体质量控制;四、结晶的应用;第五节 电泳;电泳的类型;二、琼脂糖凝胶电泳 ;在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。;电泳仪;琼脂糖凝胶电泳装置 ;操作流程大致为： 凝胶的制备→胶板的制备→加样→电泳 →观察和拍照。;操作步骤;称量、加入缓冲液;溶 胶;准备胶槽;凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml;铺 胶;凝胶凝固后取出梳子;加缓冲液;准备样品;点 样;电 泳;注意观察溴酚蓝染液的迁移;;紫外灯下观察电泳结果;照 相;三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;;;SDS;聚丙烯酰胺凝胶制胶装置;;实验步骤;试剂名称;2.分离胶的制备 胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。 3.浓缩胶的制备 用滤纸吸干水→倒入 浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。 ;二、样品处理与加样 1.样品处理 2.加样 小心拔出梳子 上下槽 注入电极缓冲液 用 微量进样器点样 三、电泳 接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开开关，保持恒压进行电泳。 ; 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。;流程图;五、等电聚焦;第六节 蒸发与干燥;二、干燥;2. 生