生物化学及分子生物学七年制实验一.pptVIP

生物化学和分子生物学实验;第一节 分光光度法(Spectrophotometry); 溶液的颜色实质是它所吸收的色光的互补色。如：日光照射KMnO4，其中绿光被吸收，故溶液呈紫色。CuSO4呈蓝色是由于溶液吸收了黄光。;互补色;光;可见光;光的吸收定律;A=KLC;波长的选择 ;1．应使被测溶液有适当的光密度，适当的光密度为0.1—0.7，而以0.2—0.6最理想。 2．应使干扰影响降低至最低限度。 3．应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。;待测溶液浓度的计算 ;利用标准管法计算待测溶液的浓度;实验步骤;实验记录;公式计算法求蛋白质浓度;1．标准曲线的作用 (1) 从浓度一 光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符合Lamben—Beer氏定律。 (2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作，仪器等误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。 (3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。 (4)当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。;2．标准曲线的作法 ;实验步骤; 3.标准曲线图的绘制：;绘制标准曲线;C mg/ml;第二节 蛋白质定量分析;主要方法;双缩脲法;蛋白质的双缩脲反应;实验步骤;标准曲线;蛋白质的紫外吸收;实验步骤;BCA测定蛋白质浓度;管号 试剂(μl);双缩脲法：540nm，玻璃比色杯，vis-7220 紫外法：260，280nm，石英比色杯，uv-9200或者uv-9600或者uv-2000。调节不同波长时需要再次调零 BCA法562nm，用0.5cm的比色杯，同时应特别注意，BCA法的标准品与双缩脲和紫外法的不同 双缩脲与BCA需做标准曲线。紫外法不需做标准曲线。;实验报告;双缩尿/BCA法测定蛋白质浓度;实验报告;双缩脲测定蛋白质浓度计算;BCA测定蛋白质浓度;紫外分光光度法测定蛋白质浓度;实验一 蛋白质定量分析技术;双缩脲法 紫外分光光度法 BCA（二喹啉甲酸）法 Lowry法(Lowry改良法) 考马斯(Comessie)亮兰结合法 凯氏定氮法 ;一、双缩脲法测定蛋白质含量;双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。;优点： 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一； 测定浓度范围：2-10mg/ml； 操作简便、迅速； 受蛋白质种类性质的影响较小，常用于蛋白质分离纯化的早期步骤。 缺点： 灵敏度较差； 而且特异性不高，除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。 ;【操作】;【结果】;二、紫外分光光度法测定蛋白质浓度;【原理】;优点：操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化蛋白质的微量测定。 缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，可产生一定误差。 混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。;将样品按表稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得吸光度值。 计算公式： 1、A280/A260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式： 样本蛋白质含量(mg/ml)=1.45A280 — 0.74A260 2、A280/A260＞1.5时，用Lamber-Beer定律计算： 样本蛋白质含量(mg/ml) =A280/K×L=(A280/6.3×1)×10g／L 实验样品：牛血清白蛋白：E1%1cm= 6.3[100ml/(cm.g) K: 摩尔消光系数； E1%1cm: 百分消光系数。;三、BCA（二喹啉甲酸）法测定蛋白质;【原理】;【优缺点】 1、操作简便，快速； 2、准确灵敏，试剂稳定性好； 测定范围：20-200μg/ml；微量：0.5-10μg/ml; 3、经济实用，可在微板孔中进行，大大节约样品和试剂用量； 4、抗试剂干扰能力强。;【操作】 ;原始数据记录;【实验报告】