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海南大学农学院 专业实验技能课程实验报告 姓 名： 李成梁 学 号： 12071010210009 年 级： 12级 专 业： 生物化学与分子生物学 导 师： 陈惠萍教授 序号实 验 名 称成绩1水稻糊粉层的剥取902水稻糊粉层总RNA的提取903反转录成cDNA804期 终 成 绩87 导师签名： 时间： 年 月 日 水稻糊粉层的剥取 实验目的 剥取水种子的糊粉层，为提取水稻糊粉层总RNA做准备 实验材料：水稻优Ⅲ128种子 实验药品和器材： 1%高锰酸钾溶液 无菌水 DEPC水 灭菌后的培养皿、解剖针、解剖刀、滤纸 无菌操作台 实验方法与步骤 1、用灭菌后的培养皿盛30粒种子，用1%高锰酸钾溶液对种子消毒10分钟后用无菌水冲洗3遍，倒入DEPC水。 2、在无菌操作台上对材料种子去头去尾、保留中间部分，放入恒温培养箱培养72小时。 2、把装有材料的培养皿转移至无菌操作台上，剥取谷壳后剥取糊粉层。 五、结果与分析 可以获得较好的水稻优Ⅲ128种子的糊粉层 水稻糊粉层总RNA的提取 一、准备试剂 β-巯基乙醇，液氮，研钵，无RNase离心管，5 M NaCl，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase水（DEPC水）。 二、方法步骤 1， 取不多于0.1 g冷冻的研磨过的植物组织（15片糊粉层），加0.5 ml提取试剂（4℃），振荡至彻底混匀。冰上平放放置5 min。 2， 4℃ 12, 000 rpm离心1 min（2min），上清（约400ul）转入新的无RNase离心管， 加入0.1 ml 5 M NaCl，温和混匀。 3， 加入0.3 ml 氯仿，上下颠倒混匀， 4℃ 12,000 rpm离心10 min，取上层水相（约300ul）转入新的无RNase离心管。 注意：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可重复步骤5、6一次（离心时间15min）。 4， 加与所得水相等体积的异丙醇（约150ul），混匀，室温放置10 min。 5， 4℃ 12,000 rpm离心10 min。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。加1 ml 75%乙醇。（沉淀可能很难看见，应小心操作。） 6，4℃ 5,000 rpm离心3 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀。剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸???，室温晾干2-3 min。 7， 加50 μl无RNase水（DEPC水），反复吹打、混匀，充分溶解RNA。如有絮状物，可在室温条件下12,000 rpm离心1 min，取上清转入干净的无RNase离心管中，-70℃保存。 三、结果与分析 获得的产物经琼脂糖凝胶电泳验证可用于后续的RT-PCR 反转录成cDNA 实验材料 已获取的水稻优Ⅲ128种子糊粉层 实验药品 FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（去基因组） 三、操作步骤 50 ng-2 μg总RNA可建立20 μl反应体系。 1. 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。 （以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。） 2. 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3 min。然后置于冰上放置。 表1 gDNA去除反应体系5×gDNA Buffer2 μlTotal RNA -8 μlRNase-Free ddH2O补足到10 μl（0μl） 3. 按照表2的反转录反应体系配制混合液。 表2 反转录反应体系10×Fast RT Buffer2 μlRT Enzyme Mix1 μlFQ-RT Primer Mix2 μlRNase-Free ddH2O补足到10 μl 4. 将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。 5. 42℃，孵育15 min。 6. 95℃，孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。 四、实验结果 用试剂盒通常能够获得较好的cDNA