试验一 氨基酸的分离鉴定——薄层层析法.doc

PAGE  PAGE 3 试验一 氨基酸的分离鉴定——薄层层析法 注：每组带一个小格尺，一支铅笔 一、实验目的 1、掌握分配层析的原理 2、学习氨基酸薄板层析的操作方法 二、实验原理 薄层层析（thin layer chromatography ）?又称薄层色谱，是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板上，形成薄层后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。 例如：以纤维素作为支持物，将其均匀的涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析，即纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，有机溶剂是流动相，当被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，即可被分开。 三、实验材料和仪器 1、实验材料：绿豆芽、黄豆芽或萌发小麦种子 2、主要仪器：玻璃板5cm×15cm；层析缸；毛细管；喷雾器；研钵；吸管5mL；洗耳球；量筒10mL（或25 mL）；10mL塑料离心管；电吹风或烘干箱；电子天平；离心机 四、实验试剂 1、硅胶板 2、层析溶剂系统：正丁醇（分析纯）：冰醋酸（分析纯）：水＝4：1：1（V/V）。上述溶剂需在临用时配制。每组配25~30mL。层析缸内平衡几分钟。 3、显色剂：0.1％茚三酮－丙酮溶液。 4、若干种氨基酸混合标准液：天冬、亮、苯丙、脯氨酸等各取5mg，溶于1mL 0.01mol/L 盐酸溶液中，每种氨基酸浓度为5mg/mL。 五、实验步骤 1、氨基酸的提取：取已萌发好的小麦种子2g左右（或绿豆芽下胚轴2g），放入研钵中，加入95％乙醇4mL及少量的石英砂，研成匀浆后，倒入离心管中3000r.min-1离心15min，上清液为氨基酸提取液，用滴管小心吸入点样瓶备用。 2、点样：用刀片将薄层板上薄层的左右两边各让出0.5cm，防止边缘效应。在纤维素薄板上距一端1.5cm处，用铅笔轻轻划出点样记号。点样间距合适（1.3cm左右）。用毛细管吸取样品，在记号处点样，即分次滴加在薄板原点处，样品斑点直径控制在2mm左右。 4、展层：将薄板有样品的一端浸入已存放展层溶剂的层析缸中，层析溶剂液面不能高于样品线。待展层溶剂走到距薄板顶端0.5～1cm时取出此薄板（约1～2h），用铅笔在??沿处做一记号，烘干机烘干。 5、显色：将茚三酮显色剂喷雾在板上，置于70～80℃烘箱中烘干，即可观察到紫红色的氨基酸斑点，脯氨酸例外。用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸的Rf。Rf为迁移率，在恒定条件下，每种氨基酸有其一定的Rf。Rf＝原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 根据已知标准氨基酸的Rf，与小麦提取液中氨基酸的Rf比较，可确定提取液中含有哪种氨基酸。 思考题： 为什么不能用手接触硅胶板正面？ 什么是Rf值？