092406102王清洪低氧模拟剂氯化钴.pptVIP

低氧模拟剂氯化钴对胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达的影响;摘要; 为探讨S100A4基因高表达的机制, 用低氧模拟剂氯化钴处理胃癌细胞BGC823, RT-PCR、免疫组化、免疫荧光及Western blotting方法分别检测BGC823细胞中S100A4 mRNA及蛋白表达情况。结果显示, 氯化钴处理胃癌BGC823细胞后, S100A4 mRNA及蛋白表达明显增加。; 提示低氧模拟剂氯化钴可促进胃癌细胞BGC823中S100A4 基因表达。 ; 低氧是实体肿瘤的共同特征, 它是癌细胞快速增殖与血液供应相对滞后的结果。低氧引起肿瘤细胞生物学特性发生改变, 如细胞侵袭、转移能力增加, 并可能对放化疗产生耐受。低氧对细胞的影响主要通过调节基因表达而实现, 因此研究低氧环境下转移相关基因的表达变化具有重要意义。; S100A4蛋白是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一, 可降低肿瘤细胞间黏附能力、促进细胞外基质水解和重塑、增强肿瘤细胞运动能力、促进血管生成等, 在肿瘤侵袭转移过程中发挥关键性作用。现已证实S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关, 但是目前关于S100A4表达调控的研究报道甚少。低氧是否可调节S100A4表达, 尚未见报道。; 我们应用生物信息学软件在S100A4 基因的调控区预测到低氧反应元件, 推测微环境低氧可能上调S100A4 基因表达。因此本实验观察了低氧模拟剂氯化钴处理对人胃癌细胞系BGC823中S100A4表达的影响, 旨在研究微环境低氧对胃癌侵袭转移影响的机制, 并探讨S100A4基因表达调控的新途径。 ;材料和方法; 细胞培养和低氧诱导: 取低分化的人胃腺癌细胞系BGC823, 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液, 另加青霉素 (100 U/mL)和链霉素(100 mg/mL), 37℃、5% CO2及饱和湿度的条件下培养。细胞生长至60%~70%融合度后, 实验组加入含低氧模拟剂氯化钴(终浓度为100~500 mmol/L)的培养基, 对照组为正常培养基, 继续培养24 h后收集细胞。;RT-PCR检测BGC823细胞中S100A4 mRNA表达; 扩增片段长度为277 bp, 复性温度为58℃; 内参照b-actin引物序列: 上游: 5′- CCAGATCAtGTTTGAGACCT-3′; 下游: 5′- TTGAAGGTA GTTTCGTGGAT- 3′。; 扩增片段长度为480 bp, 复性温度为58℃。循环条件: 95℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 58℃复性30 s, 72℃延伸30 s, 30个循环, 72℃延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳, LabWORKS凝胶图像分析系统分析扩增产物条带的光密度值, 并通过S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值反映S100A4 mRNA表达量的高低。 ;Western blotting检测BGC823细胞中S100A4蛋白表达;免疫细胞化学及免疫荧光检测S100A4蛋白在BGC823细胞中的表达;统计学分析;结果与分析; RT-PCR结果显示, 不同浓度氯化钴处理24 h后, BGC823细胞中S100A4 mRNA表达改变如下: 100 mmol/L、500 mmol/L氯化钴处理后, S100A4 mRNA表达无明显变化, 200 mmol/L氯化钴处理后S100A4 mRNA表达明显升高。采用200 mmol/L氯化钴处理细胞重复实验3次, 结果显示实验组mRNA表达(1.5567±0.2676)显著高于对照组(0.8267±0.1850)(P0.05), 可见200 mmol/L 氯化钴处理可以使S100A4 mRNA表达显著增高。;氯化钴对BGC823细胞S100A4蛋白表达的 影响;免疫组化和免疫荧光检测S100A4在BGC823细胞中的表达; 讨 论; 氯化钴处理后S100A4蛋白表达较对照组明显增高, 表明微环境低氧可使胃癌细胞S100A4基因表达增高; 而S100A4作为一种重要转移相关基因, 其高表达可使胃癌细胞生物学特性发生变化, 如侵袭转移等能力增加, 因而促进胃癌的进展, 可见S100A4是低氧对胃癌细胞影响的一个重要介导者。; 本研究首次证明低氧模拟剂氯化钴处理可以使胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达增高, 该结果加深了低氧对胃癌侵袭转移影响分子机制的认识, 同时也发现了S100A4 基因表达调控的新途径-微环境低氧。该结果为胃癌侵袭转移的防治研究提供了重要科学依据, 也为其他肿瘤的研究提供了新思路。;参考文献; [4]