gsg-第二章 生物样品的制备.ppt

生物分析化学;*;*;生物样品预处理需要考虑的主要问题：;生物样品预处理需要考虑的主要问题：;;物理、化学及生物学性质的考虑： 1、水溶液和各种有机溶剂中的溶解性； 2、不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性； 3、对温度、含水量和冻干时的稳定性； 4、分子的大小、带电的情况、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的扩散系数等； 5、对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性等； 6、对其他生物分子的特殊亲和力； 7、组织及细胞内的定位分布等。 ;生物样品包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。;*;血液 血样的采集（采动脉血好还是静脉血好？） 血样的制备（如果你取血样会选择血浆、血清还是全血？）;;血液的抗凝; 血液学检查项目与采血后可保存的时间 ;（二）尿液(urine)——用于药物剂量回收、药物肾清除率及生物利用度的研究。;（三）唾液 1.唾液和唾液腺（唾液从哪里来？） 2.唾液的组成 3.疾病与药物对唾液组成、分泌的影响 4.唾液的采集（用什么方法？） 5.唾液样品的制备及特点 ;*;*;*;（四）组织 1.匀浆化法（简单，回收率低） 2.蛋白沉淀法（简单，回收率低） 3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） 4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的药物或毒物） ;（五）头发 1.头发构造 2.头发的性质（广谱性、积累性、稳定性、依时性、相关性、指纹性） 3.头发的采集与洗涤 4.头发样品的制备 ;（六）其他生物样品 1.乳汁（乳汁和新生儿） 2.精液;激光捕获显微切割技术;ARCTURUS公司;LCM基本操作;LCM的特点;A：大鼠子宫上皮H E-染色的冰冻切片样品 B：人空肠Cy2-Ab抗Cytokeratin上皮细胞冰冻切片样品 C：石腊包埋H E-染色的前列腺样品 D：人血液中Giemsa-染色的白细胞样品 E：大鼠小神经元细胞Nissl-染色的样品 F：小鼠HistoGene-染色的肾小球冰冻切片样品 ;LCM实例;细胞的破碎 ;细胞的破碎;*;*;*;*;*;*;*;细胞破碎方法;生物大分子的提取;一、水溶液提取： 稀盐和缓冲溶液对蛋白质等生物??分子的稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 考虑的影响因素如下： 1、盐浓度（即离子强度）：在低离子强度的溶液中绝大多数蛋白质和酶都有较大的溶解度，此为“盐溶”现象；中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。 2、pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值密切相关，一般提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内（pH=6～8），通常选择在偏离等电点的pH条件。 ;3、温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0～5℃的低温操作。 4、防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：可采用加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性。例如在提取DNA时加入EDTA络合Mg2+ 使DNAase失活。 5、搅拌与氧化：采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的氧化变性失活。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸可以防止肽链上的巯基的氧化。 ;二、有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和较强的亲脂性。 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中。采用稀的有机溶液提取常常可以避免水解酶的破坏。 ;例：胰岛素的溶剂提取 胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但组织样品中共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0，进行提取，因为： ① 乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活 ② 草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++ ③ pH 2.5～3.0下糜蛋白酶活性低 以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，还可同时除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。 ;; 由于样品可含有数千种乃至上万种生物分子同处于一个体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的一劳永逸的分离程序，但很多基本手段是相同的。 常用的分离纯化方法和技术有：离心法、沉淀法（包括盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性沉淀和等电点沉淀法等）、透析法、超滤、冷冻干燥等。 ;离心技术 离心就是利用离心机转子高