多克隆抗體的制备及抗体效价测定.pptVIP

多克隆抗体的制备及抗体效价测定 ;目的要求;原理; ; 抗体的制备技术经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(genetic engineering antibody)。;Ab1; 多克隆抗体制备流程;操作步骤;（一）细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清） （二）可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。 ;1）细胞的破碎（物理法、化学法）;2）提取与纯化： ①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。;; 盐析法沉淀抗原的机理;③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。 ④层析法— 凝胶过滤 离子交换 亲和层析 ⑤电泳——（略） ;;;3）鉴定： 鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、 纯度以及免疫学活性。 蛋白的含量—定氮（紫外光280nm等） 分子的质量—电泳、质谱 蛋白的纯度—电泳等 免疫学活性—免疫双扩散、免疫印迹;;（三）半抗原性免疫原的制备 1.载体选择 常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。 （1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。 （2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。 ;2.连接方法 半抗原与载体的连接有物理法和化学法。 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等； 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载???上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。; 根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法主要有以下几类： ①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。 ②带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才能与载体连接。 ③带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。;（四）免疫佐剂 某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。 ;佐剂的种类 佐剂一般包括以下几类： ①无机佐剂： 如氢氧化铝、明钒等 ②生物性佐剂： 如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等； ③人工合成佐剂： 如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； ④油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等； ⑤纳米佐剂 ; 弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）,分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成； 后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。 ; 佐剂与抗原混合乳化的方法： 研磨法 搅拌混合法; 2. 佐剂的免疫生物学作用 ①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度； ③改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。;3. 佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种： ①可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。 ②佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。 ③增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原