一株枯草芽孢杆菌分离鉴定.docVIP

产生芽孢菌霉素L，大侧柏酸，表面活性素三种物质的枯草芽孢杆菌BBK-1菌株的分离鉴定研究 Niran Roongsawang?Jiraporn Thaniyavarn?Suthep Thaniyavarn?Takayuki Kameyama?Mitsuru Haruki?Tadayuki Imanaka?Masaaki Morikawa?Shigenori Kanaya 摘要 高盐区采集了能够产生大量生物表面活性素的耐盐菌，并分离各种嗜盐菌。本实验分离鉴定了一株耐盐芽孢杆菌BBK-1，发现并证实了BBK-1菌株能产生芽孢菌霉素L，大侧柏酸，和生物表面活性素。为了深入研究耐盐菌产生物表面活性素的机理通过借助分子生物学的方法克隆编码PPTase的sfp同源基因。 材料与方法 从泰国中部采集各种样品，包括耐盐咸土，砂，海水和发酵食品，分离产生物表面活性素的细菌。将这些样品稀释涂布在石油–LBGS琼脂平板上，30℃下过夜培养。油–LBGS琼脂平板配方为(w/v)：1%细菌蛋白胨、酵母膏0.5%、1%葡萄糖、5%氯化钠、1.5%琼脂，NaOH调节pH值为7.5、覆盖表面的原油为30ml。有油晕的菌落说明生产了生物表面活性剂，(Morikawa et al. 1992)。挑取菌落，接种在LBGS液体培养基中，在30℃下200 rpm搅拌有氧培养 24h。 分离上清液，用于生物表面活性素的试验。 生物表面活性剂生产量的测定 培养液上清液中的表面张力通过环张力计测量(K6; Kruss, Germany)。 临界胶束浓度(CMC)为表面张力开始增加时的浓度。需要达到CMC稀释的定义是CMC-1被认为和原始样品中的生物表面活性素的量成比例(Sheppard and Mulligan 1987)。取表面张力低于35mN/m，最高的CMC-1值的培养液的细菌菌株进行下一步的实验。 细菌菌株和质 本实验已介绍的枯草芽孢杆菌BBK-1；源于马尔堡病毒168株并且不能产生表面活性素的枯草芽孢杆菌MI113 (arg-15,，trpC2,，hsrM,，hsmM，sfp? )(Morikawa et al. 1992)；大肠杆菌DH5α[F. ?80，lacZ?M15，recA1，endA1，gyrA96，thi–1，hsdR17, r，m，SupE44，relA1，deoR，?(lacZYA-argF)U169, λ– ]作为克隆程序的宿主；分别用来转化大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌的质粒pUC19，pCR2.1(Invitrogen, San Diego, CA)，和ptb523(Tc ;Morikawa et al. 1992)。 总DNA的提取 枯草芽孢杆菌MI113和BBK-1的基因组DNA由肌氨酸法提取、CSCL–溴化乙锭平衡密度梯度离心分离(Morikawa et al. 1992)。总基因组的提取操作 按照标准要求进行(Sambrook et al.1989)。采用阿纳格诺斯托普洛斯和斯皮宰曾描述的(1961)方法制备枯草芽孢杆菌MI113感受态细胞，感受态细胞 用于转化。使用标准试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段(Bio101, La Jolla,CA)。采用质粒抽提试剂盒(Qiagen, Hilden,Germany)大规模抽提制备质粒DNA。聚合酶链反应在第30个周期进入热循环，GeneAmp PCR 系统2400(Perkin-Elmer, Foster City, CA)。PCR引物的寡聚核苷酸通过sawady (Tokyo, Japan)或生活科技(Tokyo, Japan)技术合成，利用双脱氧末端终止法(Sanger et al. 1977)使用自动排序遗传分析仪autosequencer ABI PRISM 310(Perkin-Elmer)测定核苷酸序列。DNA测序结果采用DNAsis软件分析(Hitachi Software, Tokyo, Japan)和(NCBI,Bethesda, MD)。 BBK-1菌株的鉴定 根据伯杰系统细菌学手册(Sneath 1986)进行BBK-1生理测试。为了确定16S rRNA基因序列，BBK-1菌株的基因组RNA利用基因组DNA提取试剂盒(BIO-RAD, Hercules, CA)提取。标准PCR反应方法中合成区域编码16SRNA的DNA 通用引物为：5-AAGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 and reverse: 5-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3。扩增的基因片段用琼脂糖凝胶进行纯化然后克隆到pCR2.1 的TA克隆位点。依照上面的步骤及方法确定了16S rRNA基因的核苷酸序列。 LPBS和LPAB的分离和结构分析 将 BBK-1菌株接种在装有50