植物组织中丙二醛含量蛋白质含量及过氧化氢酶活力的测定.doc

《生物化学》实验四 植物组织中丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化氢酶活力的测定 学生：蔺秀琴 学号：0812120 指导老师：张芬琴 河西学院生命科学与工程系 08级1班 甘肃张掖 734000 摘要：本文分别以三叶草和草坪草的叶片为材料，分别采用丙二醛法、考马斯蓝法及酶活力测定的方法对三叶草及草坪草叶片内丙二醛含量、蛋白质含量及过氧化氢酶活力进行对比测定。实验结果表明：草坪草内丙二醛含量高于三叶草的，且都在532nm处吸光值最大；三叶草叶片内蛋白质含量高于草坪草叶片的；三叶草叶片酶活力大于草坪草叶片的。以上为我们充分利用其各个器官提供有力依据。 关键词： 三叶草 草坪草 丙二醛含量 蛋白质含量 过氧化氢酶活力 对比 引言：丙二醛 (MDA),无色针状晶体，易潮解，由乙醛和甲酸乙酯在碱作用下缩合而成，主要用于医药中间体，感光色素的原料。与蛋白质??相容，有潜在的致癌性。 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。蛋白质由C、H、O、N组成，一般蛋白质可能还会含有P、S、Fe、Zn、Cu、B、Mn、I等。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，都是由20种标准氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新并时刻处于动态平衡中。 酶活力（enzyme activity）一定条件下，酶活力的大小可用在酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 材料与方法 1.1材料采集：三叶草与草坪草分别取其叶片于自来水中冲洗，然后用吸水纸将水吸干待用。 1.2试剂：0.5%硫代巴比妥酸溶液 20%三氯乙酸（TCA） 1mg/ml牛血清蛋白溶液 考马斯亮蓝溶液 0.01mol/ml磷酸缓冲液 0.02mol/ml愈创木酚 一定浓度过氧化氢溶液 1.3方法步骤： 1.31三叶草丙二醛提取：分别取0.5克三叶草与草坪草叶片于研钵中，加石英砂和1ml蒸馏水，研成匀浆，转移到试管中，再用1.5ml蒸馏水分两次洗研钵，合并提取液→加入2.5ml0.5%硫代巴比妥酸溶液, 摇匀→沸水加热10min(自有气泡开始计时)，冷却至室温→离心15min取上清液量其体积V→以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白对照分别测其在450nm、532nm、600nm下的吸光度。 1.32蛋白质含量的测定：如（1）制的提取液后，分别加入5ml缓冲液，再于12000r/min 分离提取上清液，并量上清液体积，用于蛋白质含量测定和酶活力测定。如下表配置好溶液后摇匀，5minhou 后以1号管为空白对照,在595nm处测定OD值。 表1.321溶液标准曲线的测定及溶液OD值 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 100ug/ml标准蛋白（ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 样品（ ml）0.2 0.2 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.8 考马斯亮蓝试剂 （ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A595nm?????? 0. 0.137 0.288 0.360 0.524 0.604  图1.321标准蛋白质含量及吸光值曲线 图1.322三叶草与草坪草蛋白质含量 1.33过氧化氢酶活力的测定：如表2所示读取470nm处吸光值。 表1.331溶液配置及其吸光值 试剂 对照管 样品（三叶草） 样品（草坪草）0.01mol/ml磷酸缓冲液/ml 2.4 2.3 2.3 0.02mol/ml愈创木酚/ml 0.5 0.5 0.5 提取酶液/ml 0 0.1 0.1 过氧化氢/ml 0.1 0.1 0.1 混合后读出OD值，3min后再读出OD值，作差OD值差