测生理指标的方法.doc

实验路线及安排：项目主要在晋西北地区展开区域化试验，供试品种4个，均为当年生扦插苗,每个品种15株，采用完全随机区组设计进行，其中包括4个处理，3个重复。所测定内容包括12项生理指标在相应部位(根、茎、叶)的年变化规律，并从形态、生理和生物化学方面对其抗寒抗旱性机理进行研究探讨。 在每个小区分别选健康植株2株，每株取其中上部位叶片1-2片，组成混合样，编号,带回实验室用一部分样品进行抗旱指标测定,其余样品放入冰箱低温处理，处理温度为0℃、-10℃，-20℃，然后进行抗寒指标测定,每月采样一次。根的取样方法为每个小区分别选健康植株10株，挖出其部分根系组成混合样,处理方法同叶片；茎的取样方法为选健康植株10株，取其上部嫩茎组成混合样，处理方法同上。2009年10月-2010年3月 对所选材料进行人工低温干旱处理,完成相关实验指标的测定工作。低温处理通过相对电导率及相关指标评价其抗寒性；干旱处理是通过对所栽品种进行适宜土壤水分、中度干旱、严重干旱条件的人为处理，测定杨树的蒸腾速率和相应指标，评价其抗旱性。 实验方法 一．光合效率、气孔导度、蒸腾速率三项指标用光合仪直接测定； 二．水势（小液流法） 取10个干净的试管，分成A组和B组，都贴上0.05mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L 6个不同浓度标签，并向这两组试管中分别移取相应浓度的CaCl2溶液4mL。 取待测叶子数片，用打孔器在其上均匀打孔，混匀，将其分别装入A组试管（每支试管装10片），摇匀，滴入一滴相同浓度的甲烯蓝溶液，再摇匀。 用干净的毛细移液管，吸取1～2滴蓝色溶液，小心的插入装着相同浓度的B组试管中部，轻轻的挤出一滴蓝色溶液，观察蓝色液滴流动方向。 按下公式计算植物组织水势：Ψ=-iRTC 式中：Ψ为植物组织水势（MPa）；C为CaCl2溶液的摩尔浓度（mol/L）；R为摩尔气体常数，0.008314MPa·L/mol·K；T为热力学温度（K），即273+t(t为当时摄氏温度)；I解离常数（CaCl2=2.6） 三．叶绿素含量（直接浸提法） 80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。 称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时??取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。 按下列公式计算样品中叶绿素含量。 CA=12.72A663-2.59A645 (1) CB=22.88A645-4.67A663 (2) CT=CA+CB=A652×1000/34.5 (3)在652nm时可一次测出叶绿素总含量 叶绿素色素含量（mg/g FW）=(CVT/FW×1000)n (4) 以上公式中，CA、CB、CA+B分别为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的浓度（mg/L）；FW为鲜重(g)；C：叶绿体色素的浓度；VT为提取液总体积(mL)；n为稀释倍数。 四．丙二醛（MDA）含量测定 试剂： 20%三氯乙酸（TCA）溶液：20g三氯乙酸，加水80ml溶解； 0．1%的TCA溶液：取250ul20%TCA稀释至50ml； 0.5%硫代巴比妥酸溶液：0．25g硫代巴比妥酸溶解于50ml20%的TCA中。 1．取植株上一定叶位的叶片，剪成小段，混匀,称取0.3g； 2．放入冰浴的砚钵中，加少许石英砂和2ml0.05mol/LPH为7.8的磷酸缓冲液，研磨成匀浆。将匀浆转移到试管中，再用2-3 ml0.05mol/L磷酸缓冲液分两次冲洗，合并提取液； 3．在提取液中加入5 ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀； 4．将试管放入沸水中煮沸10分钟（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），到时间后立即将试管取出并放入冷水浴中； 5．带试管内溶液冷却后，3000g离心15min，取上清液并量其体积。以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测532nm、600nm、450nm处的吸光度； 6.结果计算:MDA（mmol.g-1FW）=〔6.452*（A652-A600）-0.559*A450〕*Vt/Vs*FW 式中，Vt:提取液总体积（ml），Vs：测定用提取液体积（ml），FW：样品鲜重（g） 五．SOD酶活性的测定 1、NBT反应液的制备 （a）配置50mmol/l pH=7.8磷酸缓冲液：A：取NaHPO4·12H2O 8.95g定容于500ml； B：取KH2PO4 3.4g定容于500ml；（A：B=9：1） （b）13mmol/l甲硫氨酸：在180ml50mmol/l pH=7.8磷酸缓冲液中加入348mg甲硫氨酸，待完全溶解后加入后面