第六节DNA的变性复性.doc

第六节 DNA的变性、复性 一 DNA的变性(denaturation) DNA分子是由两条头尾倒置的脱氧多核苷酸所组成，其中一条链的碱基与另一条的碱基之间有氢键连接，并以A－T，G－C互补，整个DNA分子呈双螺旋结构。在加热、碱性等条件下，链间氢键断裂，形成两条单链结构，这种现象称为DNA变性（denaturation）。 DNA在溶液中发生变性伴随着一系列的物理化学性质的改变, 如紫外吸收强度的增加,此种现象称增色效应(hyperchromicity)； 溶液粘度的降低；沉降速度增加等。这些物理常数常用来研究各种DNA结构和功能。对某一DNA来说，其紫外吸收强度(A260)是双链DNA?单链DNA。紫外吸收强度的增加与变性(解链)程度成正比。若将A260 的增加作为温度的函数作图，可得解链曲线(图2-18)。DNA的热变性常称为DNA的“融解”（ melting）， 解链曲线的中点所示温度称为Tm 或称为融点，Tm 表示使50%DNA分子解链的温度。不同种类DNA有不同的解链曲线， 也有不同的Tm ， Tm随G+C%含量呈线性增加(图2－ 19)。每增加1%G+C含量，Tm增加约0.4℃，这是由于G/C碱基对之间的氢键多于A/T对之故。溶液的离子强度Tm有较大的影响，单价阳离子浓度每增加10倍，Tm增加16.6℃。某些化学试剂能显著影响Tm 值，例如甲酰胺能破坏氢键， 使Tm大大降低。 图2- 18 DNA变性过程和变性曲线 图2- 19 G+C 含量对变性的影响 DNA在变性过程中，其分子量不变，但二级结构中的氢键破坏，在双螺旋解旋分离为两条链的过程中，一级结构中的共价键都不破坏。 DNA变性有两个阶段，第一阶段部分解链，已解开部分不规则卷曲；第二阶段为完全解开，形成两条单链，此时若迅速泠却，每条链自身卷曲，部分区域形成链内双螺旋（见图2-20）。第一阶段变形可以逆转，即当温度降低时，已解开的链又会重新盘绕，形成完整的天然双螺旋。第二阶段DNA双链完全分开，很难恢复到天然构型。 图2-20 DNA热变性过程 轻度变性，往往只有A-T分开，G-C不分开，富含A-T的区域就形成小“泡”，富含G-C区域保持双链结构，在电镜中可以可以观察到这种结构，从而推测DNA的结构特征（见图2-21）。 已变性的DNA，若两条单链硷基组成不同，嘌呤比例高低不一，分子量和分子密度也就不同，所以可以用密度梯度离心或电泳法将变性后形成的两条单链分离开来。 图2-21 电子显微镜下的DNA分子的部分变性 二 DNA复性(renaturation) 在去除变性条件下，两条变性的碱基互补的单链DNA可以恢复成双链结构，恢复原有的物理化学特性和生物学活性, 这种现象称为DNA复性(renaturation）,或称为退火（annealing）。影响变性与复性过程的主要因素是温度、DNA浓度、复性时间和盐浓度、变性剂浓度。与两条链之间碱基互补的程度当然更有关系。复性的最适宜温度是Tm下25。C，在这温度下不易发生硷基错配和链内硷基配对，如果，加热变性后将变性DNA立即置于冰中，会仍然保持变性状态。一般来说，DNA浓度愈高，复性愈快，因为在一定时间里，互补的单链DNA发生碰撞的几率愈高。时间愈长，发生复性愈多。高盐浓度易于复性，有变性剂存在下，不易复性。一般来说，DNA浓度越高，两条互补单链相遇的几率增加，复性的速率就增加。 DNA复性决定于互补单链DNA的随机碰撞, 是双分子反应，服从二级反应动力学规律, 反应速率可用下式表述: dC/dt=kC2 (1) C 代表在t时间单链DNA的浓度, k为复性速度常数。对(1)式进行积分: C/Co=1/(1+kCo ?t) (2) 当反应进行到一半时, 即在 t1/2 时, 式(2)变成 C/Co=1/2=1/(1+kCo ?t1/2) (3) 简化成 Co?t1/2 =1/k (4) 任何DNA的复性都可以用它的速度常数k来描述(单位是浓度-1?时间-1)或以速度常数k的倒数即 C0?t1/2 (单位是浓度?时间 )来表示。从方程(4)可知, 控制复性反应的参数是DNA初始浓度(C0)和保温时间(t)的乘积, 即C0?t，可读作“Cot”，用mol/L?S表示。达到半复性时的 C0?t称为 C0?t1/2。C0?t1/2 愈大, 反应就愈慢。 可以用图2-22的C0?t曲线表示DNA复性反应。用已经复性的DNA部分（1-C/C0）对C0t的对数作图。图2-22是几种基因组的C0?t曲线，从图中可见每一种曲线的