血红蛋白的提取及分离.pptVIP

2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组时代。; 本课题学习目标;知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：;知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：;②具有催化作用，如参加生物体各种生命活动的酶;;相关计算总结： 假设氨基酸的平均相对分子质量为a，由n个氨基酸分别形成1条肽链或m条肽链。 (1)氨基数＝肽链数＋R基上的氨基数 ＝各氨基酸中氨基总数－肽键数 (2)羧基数＝肽链数＋R基上的羧基数 ＝各氨基酸中羧基总数－肽键数;1.分离生物大分子的基本思路：;基础知识（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）;4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程;凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示;; 原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。;（二）缓冲溶液;①弱酸和弱酸盐组合; 生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。;（三） 电泳：;;;实例：聚丙稀酰胺凝胶电泳; 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入 SDS。;用SDS测定蛋白质分子量的方法;电泳检测PCR结果;影响蛋白质分子运动速度的因素;为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。;阅读课本相关内容，思考以下问题： 1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？ 2、样品怎样处理？ 3、蛋白质怎样分离？; 1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？;血液;血红蛋白; 二、实验操作;1、采集血样。 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。 5、低速离心（低速短时间） 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。;3次洗涤后的结果;问： 1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？ 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 3、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤， 能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？;(2)血红蛋白的释放：;②试管中溶液层次： 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 ③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。;(4)透析：;透析过程动画演示;利用透析袋透析;凝胶色谱操作:;（2）凝胶色谱柱的装填;注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ;装配好的凝胶柱; ;（3）样品加入与洗脱;（3）样品加入与洗脱;收集得到的纯化后的蛋白;思考下面的问题：;3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？;（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳; 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。;1．答：凝胶色谱法