第八章 基因工程--精品PPT課件.PPTVIP

第八章 基因工程;基因克隆示意图;;基因工程大事记;1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程;胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体 ;自然界的基因转移和重组;结合作用 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌） 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程;转导作用 transduction;基因工程;工具酶;一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖;1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。 发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。 细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。 原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。 假设：限制性内切酶与修饰酶。;;;1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：HindⅡ Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。;限制性核酸内切酶(restriction enzyme);识别和切割位点 回文结构 4～6 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端 ;粘性末端与平头末端;修饰酶;DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的活性;核酸外切酶活性;;;;;载体 vector;;常用的克隆载体;;;;;常用的克隆载体;;;;;;;cos:cohesive-end site;;;RF DNA: replicational form DNA;表达载体(expressing vector);;;;哺乳动物表达载体;重组DNA技术的基本过程;目的基因(target DNA)的制备;;;;;;载体的选择和制备：λ噬菌体、粘性质粒、 pUC系列、M13噬菌体 DNA分子的体外连接（DNA连接酶） 粘性末端连接 连接效率高 相同酶切末端 平端连接 连接效率低 人工接头(linker)法 同聚物接尾法 ;;;;;同聚物接尾法;将外源DNA导入宿主细胞;目的基因的筛选和鉴定(screening/selection);;;;IPTG;X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷);; bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237;;;克隆基因的表达;融合蛋白（fusion protein,包涵体） 表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末断由克隆的真核DNA编目。 大肠杆菌表达体系的不足 缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化 融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性 很难表达大量的可溶性蛋白;;真核表达体系;tk- 细胞突变株筛选转染细胞;药物筛选转染细胞;目的基因的定点诱变及其应用;;;;;