质粒DNA的转化制备和酶切分析.docVIP

实验8 质粒DNA的转化、制备和酶切分析 （一）质粒DNA的转化 一 目的： 1．掌握DNA转化的原理和方法。 2．了解质粒DNA转化的操作步骤。 二 原理： 质粒：是存在于细菌染色体以外的小型环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。 转化：是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。 进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。 本次实验所用的Bcl-2重组质粒含有氨苄青霉素的抗药基因(Ampr) 。因此只有当Bcl-2重组质粒转入到细菌细胞内，细菌才具有抗氨苄青霉素的抗药性（即细菌能在含氨苄青霉素的培养板上生存并形成菌落）。通过将经过转化的细菌细胞在含氨苄青霉素的培养板上进行筛选，我们可以鉴别出Bcl-2重组质粒到底有没有进入到细胞内。 本实验采用 CaCl2法制备感受态细胞：0-4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中（本次实验是人 Bcl-2 重组质粒）的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型。 转化后在含 Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA 。 三 材料与试剂仪器： 1．菌种及质粒：大肠杆菌DH5α；人Bcl-2重组质粒 ； 2．培养基：含氨苄青霉素的LB琼脂平板、LB培养基； 3．试剂： 0.1 mol／L CaCl2（灭菌）；氨苄青霉素； 4．仪器：恒温水浴箱；超净工作台；高速冷冻离心机；恒温摇床； 恒温箱；消毒离心管。 四 操作步骤： 1．制备感受态细菌（已制备好）； 2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH-5α：（实验流程如下所示） 100ul感受态细胞DH-5α+5ul人Bcl-2重组质粒───→轻轻旋转混合───→冰上放置30min───→42 ℃,热激120S───→冰浴2min───→400ul LB培养基───??37℃, 50r/min振摇45min───→取200ul涂布于含Amp琼脂板───→室温放置，使液体吸收───→37℃倒置培养12~16h 3．次日观察结果，在含抗生素的琼脂平板上有菌落生长者即为转化细菌，未转化细 菌无菌落生长。 五 结果和讨论： 比较对照平皿和转化平皿，转化平皿中有白色菌落生长，说明转化成功。 六 注意事项： 1．感受态DH5α细菌很脆弱，加入Bcl-2重组质粒5μl后，要轻轻旋转混合，禁止剧烈振摇或吹打。 2．42℃水浴2分钟时，时间和温度要准确，中途不要摇动离心管。 3．无菌操作要严格，防止外界细菌污染。 4．细菌铺板密度不能过高，倒置培养时间不能过长（12～16h内）。 （二）碱裂解法制备质粒DNA 一 目的： 1．掌握碱裂解法分离质粒DNA的原理和方法； 2. 了解提取过程中各试剂的作用。 二 试剂： 1．溶液I：50mmol/L葡萄糖+10mmol/L EDTA+25mmol/LTris(pH8.0)+ 2g/ml溶菌酶(临用前加) 葡萄糖:增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力而降解； EDTA:螯合Mg2+,Ca2+,抑制DNase;有利于溶菌酶作用(低离子环境)； 溶菌酶:溶菌,但pH8.0该酶受抑制； 2．溶液II(临用时配制)：0.2 mol/L NaOH+1% SDS NaOH :核酸在pH5～9稳定,但在pH12或3则变性, 溶液II中pH为12.6, 可使染色体和质粒DNA变性； SDS（离子型表面活性剂）：a:溶解细胞壁上的脂质与蛋白,破坏细胞壁;b:解聚胞中的核蛋白;c:与蛋白质结合成复合物,使蛋白变性沉淀;d:抑制RNase,下一步需除去。 3．溶液III：29.4g KAc+11.5ml HAc+加ddH2O至100ml 所配溶液对K+是3mol/L,对Ac-是5mol/L, pH4.8 KAc-HAc缓冲液(pH4.8): 把pH12.6的抽提液调回pH至中性,使变性的质粒DNA复性,并稳定存在,而高盐的KAc有利于变性的染色体DNA、高分子量RNA、和K+-SDS-蛋白质-细胞壁复合物凝聚而沉淀。 三 原理： 碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 在pH12.6的高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA超螺旋共价闭合环状结构的两条