質粒DNA的提取纯化与鉴定.pptVIP

质粒DNA的提取纯化与鉴定; 一、基因克隆的质粒载体;2、载体性质 （1）.复制能力； （2）.容纳外源DNA的能力； （3）.选择标记：抗生素耐受。 （4）.引入多克隆位点； （5）.引入重组选择标记。 ;3、载体分类： 按功能分 1.克隆载体 2.表达载体 按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬 菌粒、 λ噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、 昆虫杆状病毒 3.穿梭载体 ; 4、常用质粒载体 例如：1. pBR322、pUC 18/19、 pUC118/119、pGEM、 pBluescript、 pBluescript SK/KS等 2. pET、pGEMEX、pGEX等 3. pALTER等 5、常用质粒宿主： HB101、DH5α、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等 ;二、质粒DNA的分离纯化;（二）、质粒DNA的提取 1．将过夜培养的2-4m1细菌，12,000rpm高速离心1分钟，彻底去除上清。(菌液较多时可以多次离心收集菌体)2．加入200 ? l solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。（注：Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。）3．加入250 ? l Solution II，立即轻柔上下颠倒离心管5-10次，使细菌裂解，室温放置(2-5分钟左右)至溶液变成澄清。（注：温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。） 4．加入350 ? l Solution III，立即轻柔上下颠倒5-10次至出现大量白色絮状沉淀，使之充分中和，室温放置2分钟。5．12,000rpm高速离心15分钟。 ;6．取出2ml样品收集管和吸附柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清小心吸取全部转移到吸附柱里。12,000rpm离心1分钟。7．取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一支收集管中，吸取700 ? l Wash Solution到吸附柱，离心1分钟。8．重复步骤7一次。9．取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将柱放入同—支收集管中，12,000rpm高速离心2分钟。10．将吸附柱放入干净的1．5m1的离心管中，在柱子膜中央加30-50 ? l TE或灭菌纯水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温12,000rpm高速离心1分钟。 注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。 11．???1-2? l洗脱液做浓度测定，1%琼脂糖凝胶电泳或酶切分析。;三、质粒DNA的鉴定;质粒的电泳图谱; 质粒DNA的鉴定和酶切分析 ; 实验原理 DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。;一般提取的质粒有3种构型： 超螺旋的共价闭合环状 开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂 线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂。 通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快， 其次为线状DNA， 最慢的为开环质粒DNA。 ;实验步骤1、制备1％琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀。2、胶板的制备 1） 选择适当大小干净的有机玻璃内槽，放好样品梳子。 2）将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入3-5μl EB储存液（2mg/mL）摇匀，缓缓倒入有机玻璃制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 3）待胶凝固后，小心地拔出梳子，将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。 4）加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。3、加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品（5μl质粒+1μl 6× loading buffer)加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 4、电泳1）．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。2）．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。 ;限制性内切酶; 酶切产生的末