第3章节基因克隆载体.pptVIP

3 基因克隆载体;定义 通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。也称DNA克隆载体。 必备条件 1、克隆位点(一个或多个) 2、能携带外源DNA片段进入受体细胞: 能自我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制而复制。 3、有选择克隆子的标记基因 4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞) 意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建新载体一直是基础研究的优先领域。;按克隆载体的来源分： 质粒～ 病毒或噬菌体～ 质粒与病毒或噬菌体DNA组成的～ 质粒与染色体DNA片段组成的～;３.１ 质粒克隆载体 定义： 以质粒DNA为基础构建而成的载体，适于原核和植物的基因转移、建立基因组文库和c DNA基因文库。;构型：;２、分子大小： 100～102 kb;复制强度：拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定 严紧控制型：1~数个拷贝；大质粒 松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。 经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达3000个）。;（２）质粒复制的控制因素 cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续复制。;rep基因：指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制;４、质粒的不亲合性 亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒 不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒 意义：宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒 ５、质粒迁移 （１）接合质粒： 含tra基因→合成细胞表面物质（鞭毛）→质粒DNA入受体细胞 含tra基因的质粒称为接合质粒。如F、Ti等 不含tra基因的质粒称为非接合质粒。如ColE1、pPbS等;（２）迁移作用 不含tra基因而含bom（oriＴ）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒mob基因产物时，即可打开oriＴ位点，非结合质粒借助接合质粒tra基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称～;６、显性质粒和隐蔽质粒 宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性（表达型）质粒。 显性质粒 Ｒ质粒??含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的抗性基因，可作为选择标记。 Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒 隐蔽质粒 蓝藻内源质粒;二、 质粒克隆载体构建的基本策略 １、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等;三、质粒克隆载体构建 过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重组） 构建原则 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、克隆位点、启动子和终止子 2、正确获得构建质粒克隆载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子 5、构建过程力求简单 代表性实例。;（一）pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建 Ⅰ、pBR322构建 质粒载体命名法则 “pBR322” p：质粒（plasmid ) BR：两位主要构建者 322：实验编号 pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧型 ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂 ;;构建过程(出发质粒：pMB1);R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19 （含易位子Tn3 Apr） R1drd19 Tn3 pSF2124 ColE1 pBR322的三个亲本：pMB1、pSF2124、pSC101 识别位点： Apr基因区（3个 ）： PstⅠ、Sca Ⅰ 、Pvu Ⅰ Tcr基因区（7个 ）：BamH Ⅰ 、Scal Ⅰ 、EcoRⅤ、 Sph Ⅰ 、Nhe Ⅰ 、Nru Ⅰ 、XmaⅢ Tcr启动子区（2个 ）：Cla Ⅰ 、HindⅢ pBR322分子大小：4363bp;;;3、优点 （1）较小的分子量 10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA （2）较高的拷贝数 经氯霉素扩培后达1000～3000 copys/cell （3）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。插入失活（图解）;;Ⅱ、pUC18/19质粒载体 与pBR322区别：乳糖操纵子的一个DNA片段（lac Z`基因）替换Tcr基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆 命名p UC——University of California