酶联免疫吸附实验ELISA--操作规则新手适用.doc

PAGE  PAGE 30 酶联免疫吸附实验 ELISA －－操作规则（新手适用） 一、实验目的 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 二、实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 （二）酶与底物 酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。 免疫技术常用的酶及其底物 酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺橘红色492*四甲替联苯胺黄色460**氨基水杨酸棕色449邻联苯甲胺兰色4252，2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐蓝绿色642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)黄色400萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐红色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405，420葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰深蓝色β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)荧光360，450硝基酚半乳糖苷(ONPG)黄色420*? 终止剂为2mol/L H2SO4 ** 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。 可催化下列反应： HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物， 供氢体； A—— 为有色产物。 （三）ELISA常用的四种方法 1．直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面； 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； 加底物。底物的降解量＝抗原量。 2．间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面； 加抗体， 形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体； 加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。 3．双抗体夹心法测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); 加底物。底物的降解量＝抗原量。 4. 竞争法测定抗原 将抗体吸附在固相载体表面; (1) 加入酶标抗原； (2)，(3)加入酶标抗原和待测抗原； 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 三、仪器和材料 1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板， 40， 96孔)。 2. 酶联免疫检测仪 3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG， 工作稀释度1:1000。 4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存，　Na2CO3 0.15克， NaHCO3 0.293克，蒸馏水稀释至100 ml。 5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20， ４℃，保存. NaCl 8g， KH2PO4 0.2g， Na2HPO4.12H2O 2.9g， Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。 6. 洗涤液：同稀释液 7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。 8. 邻苯二胺溶液(底