重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成Y-氨基丁酸条件的优化.docx

重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成Y-氨基丁酸条件的优化 (南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095) 摘要:研究重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌合成、Y-氨基丁酸 (y-aminobutyric acid GABA)的适宜条件。检测温度、pH值、表面活性剂、金属离子、底物与菌体质量比以及反应体系体积对GABA转化效率的影响。结果表明:最优转化条件为:转化体系5 mL、底物L-谷氨酸钠浓度0.1mol/L、重组大肠杆菌细胞6.4mg(干质量)、Triton-100体积分数0.06%。Ca2+浓度0.6mmol/L，转化温度45℃、反应体系pH4.5。在该体系下反应7 h, GABA合成量达到26.1 g/L, GABA转化效率在1h时达到最高，为13.8 g/ g.h)，较优化前提高1.5倍。 关键词: Y-氨基丁酸;谷氨酸脱羧酶;转化条件;优化 Y-氨基丁酸（y-aminobutyric acid GABA)是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质。GABA具有许多重要的生理功能，如降血压[1}、预防癫痫[2]、抗抑郁[3]、抗疲劳[4]l、控制哮喘[5]和促进激素分泌等。山于GAGA具有诸多重要的生理功能，已经发展成为一种新型的功能性因子，正逐渐被广泛应用于食品保健、医药、化工及饲料[6]等领域。目前，国内外都在积极研发富含GAGA的食品，己成功研发的有茶饮料、米胚芽、功能性饮料、乳制品和大豆发酵制品[7-9]。 微生物法制备GAGA的优点很多，如安全性较高、反应条件温和、生产成本较低以及较好的商业化开发应用前景等，因此，近年来微生物法制备GAGA受到国内外学者广泛的关注，其中大肠杆菌、红曲霉、酿酒酵母、乳酸菌等GABA生产菌种研究较为深入。已有很多研究证明乳酸菌具有合成GAGA的能力[10-13]，乳酸菌作为一种有保健作用的益生菌，用其合成GAGA越来越受到人们的青睐，目前用乳酸菌合成GAGA的研究主要集中在菌株的筛选、传统诱变方法以及发酵条件优化上，但是，山于乳酸菌具有发酵周期较长以及培养条件较难制等缺点，在生产强度上处于劣势，而借助基因工程手段构建高拷贝重组质粒，导入宿主菌，可以使谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)表达量提高，获得高GAD活性的基因工程菌，从而缩短生产周期，提高生产强度。 GABA对紫外、可见光及电化学都不灵敏，直接检测GABA很困难。目前报道的有纸层析法[14]、薄层扫描法[15]氨基酸分析仪法[16]、毛细管电泳法[17]、高效液相色谱[18]及气相色谱-质谱法[19]等，其中高效液相色谱法可定量检测GAGA，相较氨基酸分析仪法成本低、分离时间短，是一种较为常用的方法。 谷氨酸脱羧酶基因gadB来源于菌株Streptococcusthermophilus Y2，将其与E. coli，表达载体pET-23a连接构建重组表达载体，转入E. coli，获得gadB基因工程菌E. coli BL21 (DE3)-[pET-23a-gadB ] [20]。利用该基因工程菌催化L-谷氨酸钠生成GABA，通过研究温度、pH值、表面活性剂、金属离子、底物与菌体质量比以及反应体系体积对GABA转化效率的影响，确定该菌株转化合成GABA的最佳转化条件，通过在此最佳转化条件下合成GABA，以期提高GABA转化效率，达到全细胞转化法高效制备GABA的目的。 1材料与方法 1.1菌种、培养基与试剂 Escherichia coli BL21 (DE3)-[pET-23a-gadB]由南京农业大学酶工程研究室保藏。 种子培养基和发酵培养基(LB培养基):胰蛋白陈10 g,酵母提取物5 g, NaCl 10 g，加水溶解后，加去离子水定容到1 000 mL。使用时向其中添加经过滤除菌的氨节青霉素，抗生素终质量浓度为100 μg/mL。 GABA(纯度≥99% )、丹磺酰氯 美国Sigma公司；曲拉通X-100 广东光华科技股份有限公司；四氢呋喃(色谱纯)、丙酮 上海凌峰化学试剂有限公司；冰乙酸(色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司； 甲醇(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。 1.2仪器与设备 HYG-A全温摇瓶柜 太仓实验设备厂;AY120电子精密天平 日本Shimadzu公司;隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；手提式蒸汽压力灭菌器 上海医用核子仪器厂；5804R高速冷冻离心机 德国Eppendorf基因公司; SW -CJ-IBU超净工作台 苏净集团安泰公司;Agilent 1100 series高效液相色谱系统美国安捷伦公司。 1.3方法 1.3.1重组大肠杆菌细胞的制备