新型微生物实验22437.ppt

环境微生物学实验;本课程是环境科学、农业资源与环境等专业开设的一门独立的专业基础课实验 ,其宗旨是着重训练学习掌握微生物学最基本的操作技能，如显微镜的使用方法，微生物的基本形态观察，细菌染色技术，土壤、水体、空气中微生物的检测等。了解微生物的基本知识，通过观察具体材料和实验结果以加深理解和巩固课堂讲授的某些环境微生物学理论；同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力。本课件的内容主要包括：荧光原位杂交法检测活性污泥中的硝化细菌、微生物的接种技术、细菌染色及微生物观察，土壤、空气微生物检测、水体中大肠菌群细菌的检测等。; 实验一细菌染色法及微生物的观察; 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。 ; 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。; 一、实验目的和内容;二、实验??料和用具;;3、荚膜染色： (l)在阿须贝(Ashby)无氮培养基上培养3—5天的团褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或者培养2—3天的硅酸盐细菌(Bacillus mucilaginosus subsp silicus) (2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色液。 (3)载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜。 ;4、鞭毛染色： (1) 在牛内膏蛋白胨斜面上培养19—24小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培养体在取用前经过每日移植—代，连续移植5～7代。 (2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。 (3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、洁净载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜． ;5、芽孢染色： (1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培养24～36小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。 (2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子。 (3)显微镜。 (4)香柏油、二甲苯、擦镜纸． (5)孔雀绿染色液、蕃红染色液。 ; 三、操作步骤;（4）染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4—10d)。 （5）水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图4—10e)。 （6）干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图4—10f)。 （7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。; 图4－10 单染色方法 ;（二） 革兰氏染色法;2、染色 （1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。 （2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗： （3）滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。 （4）复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。 （5）用滤纸吸干，油镜镜检。;3、结果 革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 4、检测未知菌 用以上方法对未知面进行革兰氏染色，并绘图、记录染 色结果。;1．石炭酸复红染色 (1)取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(荚膜是多糖类物质，不可用火焰烘干)。 (2)滴入1～2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。 (3)加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然干燥。 (4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，在以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。 (5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。 ;2．背景染色 (1)先加