第8章高效液相色谱补充内容.pptVIP

第八章 HPLC的补充内容;液相色谱键合相的类型和色谱性质的主要影响因素;高效液相色谱键合固定相的类型;1、硅-氧-碳键型固定相 制备方法之一： 高压、过量醇、280度条件下与硅胶的硅羟基发生反应。 制备方法之二： 亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶，再与过量醇进行醇解反应。 缺点：容易被水解 ;2、硅-氮-碳键型固定相 制备方法： 先将硅胶表面氯化，再使伯胺与氯化硅胶反应。 对有机溶剂和pH=3-8的水介质稳定。;3、硅-氧-硅-碳键型固定相 制备方法： 硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅氧烷进行硅烷化反应 。 对有机溶剂和pH=2-8.5的水介质是稳定的。 ;4、硅-碳键型固定相 制备方法： 氯化硅胶和有机锂或格氏试剂反应。 稳定性优于硅-氧-碳键型固定相，但生成的产物覆盖度较低。;键合固定相的性质;2、键合相链长的影响 对于反相色谱固定相 键合相链长越长保留越强 对于正相色谱固定相 链长的影响不明显。 3、键合固定相基质性质的影响 基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、覆盖度等，都会对键合相有一定的影响。 ;高效液相色谱的色谱柱和流动相;色谱柱;硅胶色谱柱填料的优势 硅胶有良好的机械强度 硅胶的孔结构和比表面积容易控制 硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性 硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化学键合修饰 ;硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应 碱性分析物严重拖尾，分离度低。;反相色谱柱填料保留性能随温度的变化;提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能 提纯硅胶，利用高纯(99.999%)硅胶色谱填料 对硅胶进行充分封端（尾） 利用空间位阻掩蔽残余硅羟基 键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、酰胺基） 双齿键合相;高效液相色谱的流动相;高效液相色谱方法的选择;色谱条件的影响;40度 169bar;SB-C8 4.6X75mm 3.5um 流通池: 5mm, 2.5uL 20~60%B (10min.) 2mL/min.;5um 色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm;-CN柱;液相色谱仪器的维护;液相色谱仪器的维护和维修;;过滤有机相流动相用有机（聚四氟乙烯）滤膜。 过滤水或盐溶液作为流动相用水相滤膜。 盐溶液作为流动相时，需要先将盐溶解后再进行??滤，不能先过滤完水再溶解盐，防止盐中的固体不溶物堵塞流路。 注意：用于过滤无机流动相的滤膜溶于有机溶剂。;样品需要用0.22μm的微孔滤膜进行过滤;样品需要用0.22μm的微孔滤膜进行过滤;流动相中的固体颗粒和密封圈碎屑会堵塞过滤白头，导致泵压过高，需要及时更换。;安捷伦液相色谱仪更换过滤白头;密封圈老化、磨碎，导致漏液;检测器的维护一 氘灯（寿命2000h左右，价格5000-6000元） 不宜频繁开关 开+关=4小时 需要用时才开，不使用时最好关闭 冲柱（平衡或冲洗）时可以不接检测器 一是节省灯的使用，二是防止污染检测器 多数仪器的检测器电源开关在开机时就已打开，但灯的开关并没有开。;检测器的维护二 不用时充满有机流动相，如甲醇，乙腈等。 长时间未用在开始使用时检测器内可能会有气泡，现象是检测信号呈锯齿状剧烈大幅度波动，解决方法是快速堵住和放开检测器的出液口，堵住时使其内部压力瞬间增大放开后气泡会被冲出。 检测器（连有进出液两管）被堵，先检查是否是进液管被堵（多数情况下它被堵），用小流速倒冲，出液管连接泵。;色谱柱的维护 色谱柱的保存参考购买色谱柱的说明书，一般反相色谱柱（C18，C8等）用色谱纯甲醇或乙腈充满后用堵头密封两头冰箱内保存。 色谱柱在开始使用时（或使用完毕时），用洗脱能力强的流动相冲洗，除去上次使用时（或本次使用时）残留在固定相上的样品污染物等。 色谱柱冲洗过程中最好不接检测器，防止污染了检测器。 色谱柱使用多次后（出现柱压高、柱效低等）参考说明书冲洗再生。;色谱柱的正确连接;;常见商品反相色谱键合固定相;流动相中有机组分 含量高时;传统的键合和封端（封尾）;流动相pH低于2的环境中 传统的键合相分子容易水解而流失，造成色谱柱损伤，具体表现为保留减弱和残余硅羟基效应。;侧链位阻基团大的键合相分子 可以提高酸性条件下的稳定性;无封端;双封端;三封端;双齿 双封端;;;如何查阅色谱柱说明书;色谱柱参数;超高效液相色谱（UPLC）;仪器方面代表性的是2004年Waters公司推出Aquity 超高效液相色谱(UPLC)，Agilent公司 从2006年相继推出Agilent 1200、1260、1290具有更高耐压限和灵活性的高分离度快速液相色谱系统（RRLC）。 色谱柱方面在市场上出现了不同规格、不同品牌的亚2μm（1.7μm）的色谱柱，及性能和工作范