土壤中产淀粉酶菌株的分离B2小组.docVIP

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定 组员：王丹妮 陈丽华 党冰林 李智欣 薛佳妮 张欣一?实验目的? 1.掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。? 2.进一步掌握和熟练无菌操作技术。??? 3.掌握分离纯化微生物的方法。? 4.学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。? 二 实验原理 在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。 三?实验器材与材料? 3.1?实验仪器：? 培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml?3个，100ml?6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。 ?3.2?实验材料：? 1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。? 2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml 3.3?其它：? 棉花、棉绳、纱布等 ?3.4土壤采集：? ????采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点? 土样采集时间：2015年5月6日? 土样采集地点：陕西省西安市某生化公司淀粉生产车间周围 四?实验步骤?? ?4.1?实验流程：? ??配制培养基?→?土样采集?→?制备菌悬液?→?菌株的初选（涂布平板）→??鉴定?→?平板划线纯化?→?选育?→?筛选高产淀粉酶菌株? 4.2初选：? 4.2.1?淀粉培养基的配制? 分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。? 4.2.2灭菌? 将准备好的8支试管（装有9ml自来水）、移液管、涂布棒、培养皿等包扎好，与配制好的淀粉培养基一起放入灭菌锅中在120℃高压下灭菌20min。 4.?2.3倒平板? 将灭完菌的培养基放置于无菌工作台（紫外灯照射30min）上，待冷却到55℃左右后（不烫手即可），在酒精等下，倒入灭菌后的平板中，每个平板中约15-20ml，之后待冷却凝固。 4.?2.4?菌悬液的配制：? 将采集好的土样称取10.0g，装入盛有90.0ml无菌水，含有3至5粒玻璃珠的三角瓶中，放在150转的摇床上20min后静置至上清液澄清，上清液进行下一步稀释。? 4.?2.5?菌悬液浓度的稀释：? 取1ml上清液加入装有9ml无菌水的试管中，摇匀，然后依次取1ml加入下一个试管中，依次稀释到10-8，待用。?? 4.?2.6?涂布平板：? 用移液管分别在10-5、10-6、10-7、10-8浓度梯度下各取0.2ml土壤稀释液倒入已冷却的平板中，用涂布器涂布均匀，在平板上标注土样的浓度。把标注好的培养皿倒置放入37?℃?的恒温培养箱中培养?24?h?。? 4.3分离、纯化 在无菌工作台上，向培养了24小时的培养皿中加入碘液，观察菌落的形态，由于产淀粉酶菌株菌落周围有明显的透明圈，所以可得到产淀粉酶菌株。用灭过菌的接种针挑菌株周围出现透明圈的菌落于新的培养基上划线，标注。重复以上步骤3次，以得到较纯的菌株。? 4.4?菌落的形态观察及革兰氏染色? 将纯化的菌株进行制片，在显微镜下观察菌落的形态并进行细菌的革兰氏染色，判断菌体是革兰氏阳性菌还是阴性菌。? 4.5菌体及菌落直径测量? 将纯化好的菌株用接种针进行点种，然后培养24h。再在无菌操作台上向点种的平板上加入碘液，观察，然后用毫米刻度尺测量菌体的直径以及菌落透明圈的直径，并进行计算记录 4.6保存菌种? 在无菌工作台下，将纯化后的菌株用灭过菌的接种环挑去后在试管斜面上划线，包扎。培