6.实验室核酸制备的常用方法.ppt

核酸制备的常用方法;提纲：;DNA的分离与纯化;一、提取DNA总的原则：;二、样本来源：;三、样本采集、预处理和保存：;（二）血浆和血清;血浆DNA;（三）体液;（四）分泌物;四、DNA提取的基本步骤;各种组织细胞破碎方法;五、DNA提取的常用方法;酚抽提法主要试剂的作用： EDTA： 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 降低细胞膜的稳定性 SDS的作用： 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来 对RNA、DNA酶有抑制作用 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性 蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用 ;苯酚的特点： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二 酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。 PH8.0的Tris溶液可以抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。;DNA沉淀;（二） 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。;（三） 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb ;;六、DNA提取试验中常遇到的问题：;DNA降解的原因： 样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因： 提取的基因组DNA盐浓度过高 基因组DNA中乙醇未清除?? 基因组DNA中可能存在其他抑制因素 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因： 加入多糖，保护DNA长度;;七、DNA鉴定;浓度鉴定; 各种碱基的紫外吸收光谱;;EB与DNA的结合 ;500?l全血提取的基因组DNA电泳;纯度鉴定;完整性鉴定;;八、核酸的贮存——DNA保存 ;RNA的分离与纯化;;一、关于RNase酶;;去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。 必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。;;;1. 变性剂(denaturant) 选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂） 使用蛋白酶K(proteinase K) 使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠;; 联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。;;（2）RNA酶的蛋白抑制剂;3.还原剂;RNA提取实验前的准备;三、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法;;四、商品化的单相裂解试剂法分RNA; 变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。 保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。;四、商品化的单相裂解试剂法分RNA;五、mRNA的分离纯化;1. oligo（dT）-纤维素柱层析法 2. oligo（dT）-纤维素柱离心法 3. oligo（dT）-纤维素液相结合离心法 4. 磁性球珠分离法;;;;;;;实验步骤;;RNA鉴定;; ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????;;核酸的贮存——RNA保存