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实验五 DNA的酶切与连接 E-mail: huanglh@scnu .edu .cn 本节课讲义请到如下网址下载： http://www. sciencenet. cn/blog/insecthuang.htm 实 验 目 的 基本原理： 1、掌握限制性内切酶的特性和酶切的目的和原理 2、掌握DNA连接酶的一般性质和作用机制 基本操作： 1、掌握限制性内切酶酶解体系的建立及酶切样品的检测 2、掌握DNA连接体系的建立以及连接样品的检测 通过DNA重组技术构建DNA重组子 利用限制性核酸内切酶切割DNA和利用DNA连接酶 连接DNA是DNA重组过程中的关键步骤之一。成功的 酶切和有效的连接为后续的外源基因进入宿主细胞进行 表达提供了有效的实验材料。 酶切 连接 实 验 原 理 – 酶切 限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性 酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上， 并切割双链DNA。 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修 饰酶活性，可分为Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技 术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或 平末端的线性DNA。 II型限制性内切酶： 如: EcoRI的识别顺序为： 由两种酶分子组成的复合体，一种具有 限制性内切酶功能，另一种为独立的甲 5’…… G A A T T C ……3’ 基化酶功能，它们具有识别同一序列的 3’…….CTTAAGC T T A A G …… 5 ’ 能力，但却发挥不同的作用。 回文结构的对称轴 主要特点： 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个 或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸 以及7个、8个、9个、10个和11个核苷 酸的。在分子克隆实验中使用最普遍的 是那些识别4个或6个碱基对的限制性内 切酶。II 型限制性内切酶的识别顺序是 一个回文对称顺序，即有一个中心对称 轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全 相同。这种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端和平头末端。 限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位 （1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完 全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。 影响酶切的因素：在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液 中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增 加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。但应 该注意的是，过多的酶量和过长的反应时间会造成非特异 性的酶切(星号活性)。图:构建DNA重组子 实验原理– 连接 核酸片段可以通过连接酶的作用 连接起来而获得重组分子。 DNA连接酶催化双链DNA分子中 相邻碱基的5’- P末端与3’-OH 间形成3’,5’-磷酸二酯键。 一个DNA片段的5’-P末端与另一 个3’-OH末端相互 靠近 时，在 DNA连接酶的作用下，有Mg2+, ATP存在的缓冲系统中可以被 连接起来而形成重组分子。 DNA连接酶作用机制 常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底 物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子， 可以连接粘性末端、平末端。 T4 DNA连接酶的活性用Weiss单位表示。 1 Weiss单位是指在37℃下20min内催化1nmol 32P从焦磷酸根置换到 [γ,β-32P] ATP所 需的酶量。 材料、试剂及器具 1、材料与试剂 酶切反应： ? 标准pUC19(2686bp) ? EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液 连接反应： ? λDNA/EcoT14 I :由11条DNA片段组成： 19329、7743、6223bp、4254、3472、 2690、1882、1489、925、421、74 bp ? T4 DNA连接酶及其配套的 1