RNA的提取(精选).docVIP

KKME---专业医学搜索引擎/ RNA的提取 获得全长RNA是开展相关研究的关键。在实验室环境中广泛存在RNA酶，这些酶通常是非常稳定的，因此必须在特定的能使RNA酶变性的条件下裂解细胞，进而将RNA与其他细胞大分子分离。 下面介绍的方法中一类是在比较温和的条件下裂解细胞，并且不需超速离心;另一类则需超速离心。 提取RNA过程中要严格防止RNA酶的污染，因此首先要注意以下几点： 1.溶液的处理。所用的水和溶液必须用二乙基焦碳酸(diethylpyrocabornate，DEPC)处理，DEPC通过共价修饰灭活RNA酶，但含Tris的溶液用DEPC处理的效果不佳，Tris能与DEPC反应而使其失效。 在通风厨内戴手套操作，向每100ml需处理的溶液中加入0.2mlDEPC，剧烈摇混使DEPC分散到液体中，37℃放置过夜，高压灭活DEPC。 2.玻璃和塑料器皿的处理。高压消毒并不能有效地灭活RNA酶，玻璃器皿可在300℃焙烤4小时，塑料制品可用氯仿冲洗，不耐氯仿的可用0.2%DEPC溶液浸泡然后高压，不能高压的则需用DEPC处理过的水反复冲洗。妥善包装的新塑料器皿一般没有污染RNA酶，可直接使用。 3.进行RNA操作时必须戴手套，因为手上有极丰富的RNA酶。 一、去污剂/酚/氯仿法 此法应用非离子去污剂NonidetP-40裂解细胞膜，含核DNA的细胞核通过离心去除后，用SDS变性蛋白质，通过酚/氯仿和氯仿分步抽提除去蛋白质和脂质。如果裂解液中蛋白质较多，在有机抽提前需用蛋白酶进行消化。 试剂： 裂解液　50mmol/LTris-HCl，pH8.0，100mmol/LNaCl，5mmol/LMgCl2，0.5%(V/V)NonidetP-40，1000U/mlRNAsin，1mmol/LDTT。 操作程序： 1.收获培养细胞并用冷PBS洗涤细胞一次，贴壁生长的细胞可在原瓶中进行下一步; 2.将细胞悬浮在375μl冷裂解液，迅速混匀，置冰浴中3～5分钟; 3.用1.5mlEppendorf试管4℃离心2分钟。 一旦细胞裂解，RNA便暴露在RNA酶的环境中，虽然添加了RNA抑制剂，为了尽量减少RNA的降解，操作应尽量迅速。RNAsin通常可不加; 4.吸取上清加入另一装有4μl20%SDS的离心管，立即涡旋混匀; 5.室温下加400μl酚/氯仿/异戊醇，涡旋混匀起码1分钟，离心不少于5分钟，在水相和有机相间可见大量白色中间层。 如果中间层不紧密，可再离心一次，若仍不理想，可从试管底部吸去有机相，加入400μl氯仿/异戊醇，离心2分钟。如果总是有大量白色沉淀，可在酚抽提前加2.5μl20mg/ml的蛋白酶K，37℃保温15分钟消化蛋白质; 6.重复程序5一次; 7.移取水相至另一管中，加400μl氯仿/异戊醇，涡旋15～30秒，离心1分钟; 8.取水相，加4μl3mol/L醋酸钠，pH5.2混匀，加1ml乙醇，-20℃放置过夜(如果RNA较多，置-80℃15分钟足够); 9.4℃离心15分钟分离RNA; 10.用1ml75%乙醇/25%0.1mol/L醋酸钠，pH5.2洗涤沉淀; 11.干燥RNA并溶解在100μlDEPC处理过的水中。 12.取10μl稀释到1ml水中测OD260和OD280，其比值应为1.7～2.0; 13.贮存RNA于-70℃。 长满10cm培养皿的成纤维细胞或107淋巴细胞可获得30～100μgRNA。 二、异硫氰酸胍/酚法 本法应用RNA与胍形成可溶性复合物的特点，极大地简化了RNA的纯化步骤，获得高质量的RNA。 试剂： 裂解液　2mol/L异硫氰酸胍(guanidiniumisothiocyanate，GITC)、12.5mmol/L枸橼酸钠(pH7.0)、0.25%sarcosyl、0.1mol/LBSH0.1%8-羟基喹咛、0.2mol/L醋酸钠(pH5.2)、50%水饱和酚。 操作程序： 1.将新鲜或冻存的组织块切碎，称重; 2.迅速投入异硫氰酸胍/酚溶液中，每100毫克组织用2ml。在15ml离心管中，于冰浴中用组织匀浆器(TISSUMIZER)匀浆30秒，2次; 3.将组织匀浆转入1.5ml离心管中，加入1/10体积氯仿，剧烈混合15秒; 4.置冰浴中15分钟; 5.用台式离心机4℃14000r/min离心15分钟; 6.移取上清至另一1.5ml离心管中(大约可得一半原体积的上清)，加等体