荧光定量原理与分析方法08年.pptVIP

TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD;内容概要;实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析; 扩增曲线 荧光阈值 Ct值;Cycle（循环数）;Cycle（循环数）;Cycle（循环数）;横轴：PCR反映循环数;理想的PCR反应;非理想的PCR反应;在扩增产物达到荧光阈值时;Cycle number;内容概要;实时荧光定量PCR的分类; 特异性荧光标记： 1.TaqMan 2.Molecular Beacon 非特异性荧光标记： 3.SYBR Green ;1、TaqMan---水解型杂交探针;实时荧光定量PCR的分类－－TaqMan法的工作原理; 实时荧光定量PCR的分类; 对目标序列的高特异性 阴性结果确定 设计相对简单 与目标序列某一区域互补 重复性比较好; 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成;实时荧光定量PCR的分类;实时荧光定量PCR的分类－－分子信标优缺点;3、SYBR Green 法;;将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT);融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确; 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便，不必设计复杂 探针 非常灵敏 具有价格优势;实时荧光定量PCR的分类－－几种方法的比较;实时荧光定量PCR的分类;;内容概要;Sample;未知样品与已知浓度的标准曲线进行比较;绝对定量分析方法简介－－标准样品的制备;;乙肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 试剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe） 目录号（FP203） 设置对照：浓度为106、105 、104 、 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数;绝对定量举例：HBV病毒检测 以Taqman探针进行;扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 E%=(2.03-1) ×100% =103% ;如未知样本Ct为20.5 ;内容概要;相对定量分析方法简介－－为什么要用相对定量;相对定量分析方法简介－－内参照;方法： 双标准曲线法 2 － △△Ct ;对照样品目的基因浓度;相对定量分析方法简介——??Ct法：;实验数据：;内容概要;SYBR法实验流程及注意事项;样品制备;RT;模板准备;反应体系优化;技能要求;?Rotor-gene6000 ;数据分析;SYBR法理想实验结果－－梯度稀释扩增曲线;SYBR法理想实验结果－－梯度稀释标准曲线;SYBR法理想实验结果－－熔解曲线;SYBR法理想实验结果－－样本扩增曲线;理想实验结果－－样本熔解曲线;TIANGEN公司荧光产品;TIANGEN公司荧光产品特点;谢谢！