第17章 高效液相色谱法幻灯片.pptVIP

第十七章高效液相色谱法; 17-1 概述 高效液相色谱法的特点： 高压、高效、高速、高灵敏度。适用于高沸点、热不稳定及生化试样的分析。;17-2 高效液相色谱仪;一、流程及主要部件 1.流程;5;GC和HPLC在分离上的主要区别： GC：流动相为惰性气体，分离主要取决于 组分分子与固定相间的作用力，主要 通过改变固定相来改变对组分的选择 性。 GLC中，流动相对组分作用极弱，一定柱温 下，固定液流失主要由高柱温造成其 自身挥发，所以，在应用中主要采用 涂渍的方法制备柱子。 GSC中，无固定液流失现象。;HPLC：流动相与组分分子间有一定的亲和 力；分离是由组分、流动相和固定 相三者相互作用的结果。流动相是 极性不同的有机溶剂或缓冲水溶 液，溶解能力强。在HPLC中，固 定液分子必须键合在填料上，否则， 流失严重。另外，填料的颗粒 直径一般为3～5μm，柱子制备复 杂。因此，在应用中，主要以改变 流动相来调节分离的选择性。; 高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 还配有辅助装置： 梯度淋洗 自动进样 数据处理等;2.主要部件 (1)高压输液泵 ①压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的 固定相（10μm，常用3~5μm）， 液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高 效液相色谱的特点之一。 ②应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可 调、耐腐蚀等特性。;高压输液泵的种类： ①恒压泵—液压隔膜泵和气动放大泵。 ②恒流泵—螺旋注射泵和往返柱塞泵。;（2）梯度淋洗装置 HPLC有等梯度洗脱和梯度洗脱两种。 前者保持流动相组成、配比恒定。 后者采用两种或多种不同极性的溶剂，在分离过程中按照程序连续改变流动相的浓度配比及极性。 梯度淋洗的作用： 提高分离度 缩短分析时间 提高分析精度;梯度淋???的方式： ①内梯度—高压梯度装置（目前广泛采用） 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。（先加压后混合）;②外梯度— 低压梯度装置 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例混合后，再用一台高压泵输入色谱柱中。（先混合后加压） ;(3)进样装置 分为手动进样（进样器进样和阀进样）和自动进样（自动进样器进样）两种。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置。;(4) 高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减 小填料粒度和柱径以提高柱效。;(5) 高效液相色谱检测器 ①紫外光度检测器（UV） 最常用的检测器，可用于梯度洗脱。如固定波长型的汞灯254nm或280nm的紫外检测器、可调波长的氘灯或氢灯(200-400nm)。不锈钢池＜10μL。对UV无吸收的组分不响应；对UV吸收较大，如苯不可作流动相。;②光电二极管阵列检测器（DAD） 为新型的紫外吸收检测器。以氘灯为光源，绘制出随时间变化的光谱吸收曲线（A～λ）计算机快速处理，可获得分离组分的三维彩色谱图，得到更多信息。;18;③示差折光率检测器（RID）—通用型。 每种物质具有不同的折光指数，可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值，差值与浓度呈正比。灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。;④荧光检测器（FD） —选择性检测器 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸等化合物有响应。; 17-3 高效液相色谱法的类型 ; 影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。;1.流速 ①流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直线。 ②降低流速，柱效提高不是很大。 ③但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。;2.固定相及分离柱 ①气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱