201410植物组织石蜡切片的制作.docx

植物组织石蜡切片的制作 器具 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片、切片架等。 试剂 酒精、二甲苯、甲醛、冰乙酸、番红、固绿、明胶、中性树胶、蒸馏水等 全都过程 1．固定 2．脱水 3．脱酒精 4．浸蜡和封埋 5．切片 6．粘片 7．脱蜡 8．染色 9．胶封 10. 拍照  四、操作步骤： 1、固定和保存 （Fixation） FAA固定液(事先冷却)固定24 h以上，然后转移到70%酒精中保存。 固定时，真空抽滤2-3次，以促使固定更充分。 2．脱水与硬化（Dehydration） 3．脱酒精（透明） Dehydration in a series of ethanol Day 1 85% Ethanol 1 Hr on ice 95% Ethanol + 0.1% Eosin OVERNIGHT 4°C Day 2 100% Ethanol 30 min room temp 100% Ethanol 30 min room temp 100% Ethanol 1 Hr room temp 100% Ethanol 1 Hr room temp 25% Xylene+75% Ethanol 1 Hr room temp 50% Xylene+50% Ethanol 1 Hr room temp 75% Xylene+25% Ethanol 1 Hr room temp 100% Xylene 1 Hr room temp 100% Xylene 1 Hr room temp 100% Xylene 1 Hr room temp 4．浸蜡和封埋（Embedding） （1）从二甲苯逐步梯度更换纯石蜡，使组织渗透彻底。 （2）将材料移入纸盒中，依将所要切的方向，妥善排列，再以两手平持纸盒，移至冷水(about 18°C)中，用口在蜡面上吹气，促其凝结，待蜡面凝成簿层时(about 1 minute)，将纸盒全部沉入。水冷凝后，将纸撕去，即获蜡块，至此埋蜡完成。 （1）Embedding tissues in paraffin blocks 25% melted wax (Paraplast)+ 75% Xylene overnight 45℃ 50% melted wax (Paraplast)+ 50% Xylene 4h 53℃ 75% melted wax (Paraplast)+ 25% Xylene 4h 53℃ 100% melted wax (Paraplast) overnight 60℃ 100% melted wax (Paraplast) overnight 60℃ 5．切片 （1）用单面刀片修整蜡块，使上下面平行，下面略出，左右两边呈一定角度。 （2）安装切片刀，刀的斜度（around 7 degrees），非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免试刀麻烦。（3）刀片斜度调好后，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，然后把它固定，再转下蜡块，呈矩形才行。只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。（4）根据需要，调整控制切片厚度的机制（厚度10μm）。调度后，把它固定下来。上述四步骤完成后，就可进行切片，将切出的蜡带，平展于盒内以供粘片。 6．粘片 粘片时，以记号笔在载玻片上编号，滴加1或2滴1%明胶溶液（或直接用水），用胶头滴管将溶液涂匀，滴加1或2滴展开剂（2~4%的甲醛溶液），然后将切好的蜡带平整地放置在溶液上，置烤片机上的烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度，烤片温度为42℃。1~2min 后用滤纸吸去多余液体，再放置于烘片台上烘烤1~2min。放置于恒温环境35-40℃烘烤1-2d。一般粘片后的材料需放置2~3天后方可脱蜡、染色。 7．脱蜡 将粘有材料的载玻片放入纯二甲苯中，然后逐级过渡到蒸馏水中。 Dewaxing: 100% Xylene 15 min room temp 100% Xylene 15 min room temp 50% Xy