02 組織制备.ppt

第二章. 组织制备 (Tissue preparation) 基本原理和步骤同组织学, 包括取材, 固定, 洗涤, 脱水, 透明, 包埋, 切片, 组化和免疫组化反应, 封固和观察等. I. 取材: 材料新鲜, 器材洁净锐利, 部位准确. LM: 0.5cm3, EM: 1mm3. 3分内入(4℃)固定液. II. 固定(Fixation) A. 目的: 用固定剂(Fixative)和组织内的蛋白质反应, 使组织持久保存于接近存活时的代谢状态, 并耐受后续处理. B. 固定剂的作用: 1. 阻止溶解和损伤: 稳定蛋白骨架, 进而阻止其他物质的溶解. 2. 防止腐败和自溶: 抑制内外源性酶, 并改变组织成分的化学性质以耐受酶解. 3. 增强染色: 改变折光率, 促进染色(如苦味酸可增强酸性品红对胶原纤维的着色, 用于Van Gieson染色法中). ;C. 固定剂特点: 1. 能迅速均匀地渗入组织和细胞, 凝结或沉淀蛋白质而不剧烈改变其形态结构和功能, 并使组织所有的成分尽可能保留于原位. 2. 能引起组织膨胀或收缩. a. 引起膨胀: 甲醛(Formaldehyde), OsO4(Osmium tetroxide)和醋酸(Ethylic acid, HAc)等. b. 引起收缩: 醇类, 丙酮(Acetone)及高于5%的戊二醛(Glutaraldehyde), 以及脱水和包埋剂. ;D. 固定剂简介: 1. 性质分类: a. 醛类: 甲醛, 戊二醛, 多聚甲醛, 丙二醛(Malonaldehyde), 丙烯醛(Acrylaldehyde)和已二醛(Adipaldehyde),等. b. 氧化剂类: OsO4, 高锰酸钾(Potassium hypermanganate, KMnO4)和重铬酸钾 (Potassium dichromate, K2Cr2O7)等. c. 蛋白变性类: 甲醇(Methyl alcohol), 乙醇(Alcohol)和醋酸(Ethylic acid, HAc):等. d. 其他: 氯化汞(Mercury perchloride)和苦味酸(Picric acid)等. ;2. 单纯固定剂: a. 甲醛: HCHO. 气体. 37~40%甲醛水溶液称福尔马林. 多聚甲醛为白色粉末, 溶于水后形成甲醛单体进而形成非常有效的固定剂甲醛一水化合物甲二醇(Methylene glycol, CH2(OH)2). *. 优点: 渗透力强且迅速, 固定均匀; 增加组织的韧性且组织收缩轻微; 较好保存细胞结构, 抗原活性, 脂肪, 粘液和糖原. ;*. 缺点: 商品福尔马林中的甲醇抑制酶活性; 久存后多聚甲醛被氧化为甲酸(Formic acid), 改变pH, 故需新鲜配置; 甲醛与蛋白质形成交联生成的醛键(aldehyde bond)而封闭抗原, 免疫组化染色前常需酶消化或微波等抗原修复法解决. *. 配制: 10%磷酸缓冲液福尔马林固定剂, 适用于免疫组化染色; 加入NaCl可促进和改善染色; 醛糖钙固定剂含蔗糖(Sucrose)和钙(CaAc), 组织固定后做冰冻切片, 适合酶组化. ;;d. 醋酸: CH3COOH, 乙酸. 纯醋酸称冰醋酸. *. 优点: 是优良的核酸固定剂; 穿透速度快. *. 缺点: 使组织膨胀. e. 重铬酸钾: 水溶性桔红色毒晶体, 强氧化剂. *. 优点: 对细胞质和染色质固定良好. 未酸化的重铬酸钾虽不能沉淀蛋白质, 但可使蛋白质不溶, 防止脂类溶解. *. 缺点: 不能与酒精或福尔马林等还原剂混合使用. 固定后及时水洗防止组织脆化. f. 微波(Microwave): 对微波的功率, 温度和时间等(500W, 40℃, 20秒)要求严格, 是备选固定方法.;g. 戊二醛: OHC-(CH2)3-CHO. 常用磷酸盐或二甲砷酸盐缓冲液配制1~4%做EM前固定. 低温活性炭可吸附25%戊二醛水溶液商品中的杂质. *. 优点: 可良好地保存糖原, 糖蛋白, 微管, 内质网和细胞基质和酶活性. *. 缺点: 渗透力差; 不能保存脂肪(对CM显示较差); 没有电子染色作用; 久存pH3.5. *. 机理: 分子两端醛基都与氨基(蛋白质, 肽和氨基酸)起反应, 形成多肽链间交联. ;h. 四氧化锇: OsO4, 锇酸, 强氧化剂, 毒性高挥发性强. 避光保存和配置. *. 优点: 微溶于水但脂溶性高, 是脂类优良的固定剂. 因有强烈的电子染色作用, 常用1~2%水或缓冲液做EM后固定. *. 缺点: 穿透速度慢且穿透力弱(1.0mm3); 对糖原, 核酸, 微管固定差; 易被杂质还原成Os(OH)4而失效; 组织易收缩和破碎. *. 机理: