反芻動物饲用酵母菌株的分离、鉴定及其生物学特性研究.doc

反刍动物饲用酵母菌株的分离、鉴定及其生物学特性研究 反刍动物饲喂酵母类产品能提高反刍动物对饲料干物质、纤维素、半纤维素、蛋白质等有机物和磷的消化率(Lei等，2001)，能提高泌乳性能和产肉性能(周淑芬等，2003)。随着生物技术、畜牧业和饲料工业的不断发展，酵母类产品的开发利用已成为饲料工业一个活跃领域。酿酒酵母菌可以活化肠黏膜内的相关淋巴组织，提高免疫识别能力 　传统的酵母菌分类,是以形态特征和生理生化特性、生态学特性等表型性状为基础的。但这些表型性状只反映了很有限的遗传信息。有些酵母菌不仅细胞形态可以改变,而且生理生化性状(如对某些糖类的发酵及同化能力) 也会发生变异。因此,只靠个别表型性状的差异作为不同酵母菌种的鉴别依据有时是不准确的。为了弥补分类方法的不足,新的技术和方法不断地被引入酵母菌的分类研究中。特别是近年来,随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用,促使酵母菌分类鉴定工作有了飞速发展。对酵母菌鉴定工作来说,已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传特性的鉴定,细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类等新的层次上[1～3 ]。 本实验对分离到的酵母菌株在形态学、生理学鉴定的基础上进行了分子生物学的鉴定，并对其进行了初步的生物学特性研究。 1 材料和方法 1.1 材料 （1）饲料来源 ×××奶牛场。 （2） 培养基 GPY 液(固) 培养基、PDA马铃薯培养基液(固)培养基、麦氏培养基（醋酸钠培养基、McCLary）、克氏培养基、高氏培养基。 1．2 试验方法 1．2．1 菌种的分离、纯化及保种 增菌培养无菌称量饲料样品30g，放入盛150 ml增菌培养液并带有玻璃珠的三角瓶中，180r／min，28℃振荡培养过夜。1．3．3 细菌的分离纯化振荡摇匀增菌液后，经2层无菌纱布过滤，吸取lml菌液梯度稀释成1O_。、1O_。、1O～ 、1O 4个稀释度，各取0．1 ml涂布于YPD和麦芽汁平板上，置28℃ 恒温培养48～72 h后，挑选不同菌落特征的单菌落采用平板划线法纯化，重复操作至连续3次都为单一菌落、镜检没有发现杂菌时，编号并转接斜面以备保存和液体扩繁。 1．2．2 形态观察 （1）分离酵母菌形态特征观察：将单克隆接种于麦芽汁固体培养基， 25℃培养3 d后观察。观察菌落的形状大小，厚薄，同心圈明显与否，辐射线多少，中央的凹凸平，表面光滑度、光泽度、有无痣点、针棘、粉状或有无褶皱等，颜色(灰白、黄白、灰褐、黄褐、黄、橙红)及其它特征。 （2）细胞形态与培养特征：分离酵母细胞的显微镜观察摇匀纯培养菌液，取1 ml菌液滴加到计数板上。取一环菌液，卢哥氏碘液(沈萍，2000)染色涂片，用高倍显微镜观察细胞形状、大小、无性繁殖方式。 （3）酵母子囊孢子的观察：将鉴定菌株接种于Mcclary 培养基上, 25～28 ℃培养3～5 d, 涂片在显微镜下观察 麦氏(McCLary)培养基(醋酸钠培养基) 葡萄糖0.1g, KCl 0.18g，酵母膏0.25g，醋酸钠0.82g, 琼脂l.5g，蒸馏水l00mL。溶解后分装试管，1l5℃湿热灭菌15min。 （4） 酵母掷孢子的观察 掷孢子的形成和形态：有些酵母菌能射出掷孢子并在玻壁上形成镜像。摇匀菌液，用接种环取一环菌液在PDA 固体培养基上划S型曲线，25℃倒置培养3～7 d，观察落入培养皿盖子上的担孢子落象，取落象内的担孢子及菌落表面细胞，镜下观察。 马铃薯培养基(PDA) 葡萄糖20 g，马铃薯200 g，水1000 ml，加2 琼脂即为固体培养基， pH 自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1000 ml，121℃灭菌30 min。 （5）酵母菌菌丝体的观察： 摇匀菌液，用接种环取一环菌液在PDA培养基上划线数条，在线的中央放置1片无菌盖玻片，25℃培养5 d，镜检盖片下面菌落边部的菌丝。 1．2．3． 生理生化测试 (1) 发酵糖类:将菌种分别接种于糖发酵管（放有倒置杜氏小管的试管）中,之后用液体石蜡封口,放于25 ℃恒温箱培养,观察并记录结果。 糖发酵基础培养基：尿素lg，(NH4)2S04 29，KH2P04 2．59，MgS04‘7H20 lg， MgS04·7H20 O．19，酵母膏4．59，溶于1L蒸馏水中，115C灭菌30min。 (2) 同化碳源:采用生长图谱法,培养基为无碳培养基,先在1 mL 无菌生理盐水中接入新培养之酵母菌少许制成悬液,将此悬液全部倒入经溶化并冷却到45 ℃的20 mL 基础培养基中,倒入培养皿,使菌体在培养基中混合均匀,静置,凝固后在28 ℃把培养皿倒置几个小时,使表面不致太湿。然后在培养皿底部标记碳源名称,分别用无菌不锈钢匙,按标记加糖少许,如果结