实验三黄体酮原料药的质量分析.docVIP

实验三、黄体酮原料药的鉴别与质量分析 目的要求 复习并掌握甾体类药物鉴别反应的实验原理； 熟悉高效液相色谱的工作原理、仪器构造及操作方法； 掌握高效液相色谱法测定药物含量、检查药物杂质的操作方法； 复习并掌握内标法定量法的计算方法。 二、仪器及试药 1.器材 Agilent 1100 和Agilent 1200?高效液相色谱仪，超声波，电热恒温干燥箱，万分之一分析天平，称量瓶，称量纸，试管，容量瓶（25 mL、50 mL、10 mL）刻度吸管（5 mL、2 mL），平头微量注射器（25 uL) ，烧杯（50 mL） 2.试药 黄体酮原料药，己烯雌酚，超纯水，异烟肼，甲醇（色谱纯），盐酸（分析纯），亚硝基铁氰化钠（分析纯），碳酸钠（分析纯），醋酸铵（分析纯），甲醇（分析纯） 三、实验准备及条件 稀盐酸：取浓盐酸23.4 mL，加水稀释至100 mL，即得。本液含HCl应为9.5%-10.5%。 色谱柱（XDB-C18） 颗粒度为5 um的固定相，长150 mm 内径4.6 mm 流动相 甲醇 : 水 = 65 : 35，流量 1 mL/min 检测器 紫外光度检测器，254 nm 进样量 10 uL 四、实验原理 （一）、鉴别 酮基的反应：黄体酮分子结构中含有酮基，能与异烟肼等羰基试剂反应呈色。反应式如下： 2. 甲酮基的反应：黄体酮分子结构中含有甲酮基，能与亚硝基铁氰化钠反应呈色。反应式如下： （二）、含量测定——高效液相色谱法（内标法定量） 在化学键合相色谱中，对于亲水性的固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，这种情况称为正相化学键合相色谱法。反之，若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相化学键合相色谱法，该方法目前的应用最为广泛。本实验采用反相液相色谱法，以C18键合相色谱柱进行分离，紫外检测器进行检测，以内标法定量计算黄体酮原料药的含量。 当只需测定试样中某几个组分，而且试样中所有组分不能完全出峰时，可采用内标法定量。所谓内标法就是将一定量的纯物质（内标物）加入到准确称取的试样中，根据被测物和内标物的质量及其在色谱图上的峰面积比，求出待测组分百分含量。例如要测定试样组分i?（质量为mi）的质量分数（wi）,可于试样中加入质量为ms的内标物，试样质量为m，则计算公式： ????????? ????????????? 由于内标法中以内标物为基准，则 fs=1。 而且 （上式中：Ai、As分别为对照品和内标物的峰面积； mi、ms分别为对照品和内标物的质量。mi、ms可以用质量或摩尔质量为单位，其所得的相对校正因子分别称为相对质量校正因子和相对摩尔校正因子，使用时常将“相对”二字省去。） 采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。首先要求内标物既可被色谱柱所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰；另一方面理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它就能以准确、已知的量加到被测样品中去；同时它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。这样当操作条件变化时，更有利于内标物及欲测组分作匀称的变化。 内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。 五、实验内容及步骤 1.鉴别 ① 酮基的反应 取本品约0.5 mg，置小试管中，加异烟肼约1 mg与甲醇1 mL溶解后，加盐酸1滴，即显黄色。 ② 甲酮基的反应 取本品约5 mg，置小试管中，加甲醇0.2 mL溶解后，加亚硝基铁氰化钠的细粉约3 mg、碳酸钠及醋酸铵各约50 mg，摇匀，放置10-30分钟，应显蓝紫色。 2.含量测定 ① 内标液的制备：取己烯雌酚约50 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。 ② 测定 ? 校正因子的测定：取黄体酮对照品约25 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液和内标溶液各2 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；取10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱?，根据校正因子的计算公式算出校正因子。 供试品溶液的制备与测定：取本品约25 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀,作为供试品溶液；精密量取供试品溶液与内标溶液各2 mL?，置10 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计