實時荧光定量PCR.ppt

;实时荧光定量PCR技术研究概述;诞生;原理;2、探针类（TaqMan探针法）;方法;按荧光产生的原理有两种方法：荧光探针法和荧光染料法。 染料法 利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量。与常规PCR类似，唯一区别是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子。 探针法：与常规PCR的不同之处在于：在上下游引物外还加入了让具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比，提高了实验的特异性。目前市场上探针多样，其中以TaqMan探针应用最为广泛。 荧光素：FAM、Texas red、LC-Red640，LC-Red705 等 ;;5、标准品的制备;*;(2)、反应条件的设定 95℃ 预变性 2min ↓ 94℃ 变性 30s ↓ 55-65℃退火 30s ↓ 72℃ 延伸 30s ↓ 72℃ 终延伸 5min 扩增30-40个循环 ;(3)、反应体系和条件的优化 ?酶浓度 ?Mg+浓度 ?dNTP浓度 ?上、下游引物浓度 ?探针浓度 ?退火温度、退火时间和循环数 ?DNA模板浓度 ;6、荧光曲线与标准曲线的制作;*;7、待测品的制备 将待测样品放置在与标准品相同优化后的体系、条件下进行PCR扩增反应。 8、通过标准曲线进行数据分析 待测样品的CT值可通过标准曲线方程CT×a=-lgX0+b 求得待测样品的起始模板数,从而达到通过标准曲线对未知模板进行定量分析的效果。;荧光PCR的应用;;2.病原体检测 采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。;关于实时荧光定量PCR的相关问题;优点;减少污染：定量而荧光定量PCR 由于利用扩增进入指数增长期的Ct值来定量起始模板的数量 实现了精确的核酸定量检测有效地避免了污染，传统的PCR在扩增结束后需要电泳或紫外光下观测结果，除了易造成污染外，还对人体有害，而荧光实时定量PCR在闭管状态下实现扩增及产物分析，有效???减少了污染及对人体的危害，在大批量的标本检测中能有效地减少劳动量，提高检测通量和实现快速检测。;仍需改进之处;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.