第06章免疫沉淀试验选编.pptVIP

临床免疫学检验技术; 第六章 免疫沉淀试验  秦 雪;目录;第一节 免疫沉淀试验的基本原理;第一节 免疫沉淀试验的基本原理; 二、免疫沉淀试验的分类 ;三、免疫沉淀试验的特点 1.阶段性 免疫沉淀试验分两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合，形成不可见的可溶性免疫复合物；第二阶段则形成可见的免疫复合物。 2.特异性 免疫沉淀试验为抗原与相应抗体发生特异性结合反应的过程，因此具有特异性。 3.抗原性质 参与免疫沉淀试验的抗原必须为可溶性抗原。 4.抗体的选择 多克隆抗体与抗原多个表位结合，易形成沉淀，故非常适用于免疫沉淀试验；单克隆抗体只与抗原一个表位结合，不易形成交联。若抗原表面有两个以上相同的表位，单克隆抗体也可用于免疫沉淀试验。;第二节 液相免疫沉淀试验;液相免疫沉淀试验（liquid phase immunoprecipitation test） 是指可溶性抗原与相应抗体在含有电解质的液相介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物。根据实验方法和所形成的免疫复合物呈现的沉淀现象的不同，可将液相免疫沉淀试验分为环状免疫沉淀试验、絮状免疫沉淀试验和免疫浊度测定。;一、絮状沉淀试验（flocculation） 是可溶性抗原与相应抗体特异结合，在电解质存在的条件下，形成肉眼可见的絮状沉淀物。 此方法受抗原抗体比例的影响非常明显，常用来作测定抗原抗体反应的最适比例。 有抗原稀释法、抗体稀释法和方阵滴定法三种操作方法。;二、 免疫浊度测定（immunoturbidimetry） 原理：可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例合适和增浊剂作用下，可快速形成较大的免疫复合物，使反应液出现浊度；当反应液中保持抗体过量且浓度固定时形成的免疫复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度也随之增加，即待测抗原量与反应液的浊度成正相关；与标准曲线比较，即可计算出待测抗原的含量。;（一）透射免疫比浊试验 1.原理 可溶性抗原与相应抗体在一定缓冲液中结合形成免疫复合物，使反应液浊度发生改变，当一定波长的光线通过反应液时，被其中的免疫复合物反射、吸收而引起透射光减少，可用吸光度表示，吸光度与免疫复合物的含量成正比，在保持抗体过量的条件下，吸光度与抗原量成正比。 2.方法学评价 （1）优点：操作简便、快速、结果准确性较好、能用全自动或半自动仪器进行测试、敏感度比单向免疫扩散试验高5倍～10倍。 （2）缺点：1）抗体用量大；2）耗时长；3）抗原或抗体极度过剩时易导致免疫复合物分离；4）不宜用于药物半抗原的检测。;（二）散射免疫比浊试验 1．原理 利用抗原抗体在液相中特异性结合后产生一定大小的免疫复合物，当一定波长的光通过该反应液遇到免疫复合物时光线发生散射现象，散射光的强度与免疫复合物的含量和散射夹角成正比，与入射光波长成反比。当散射夹角和入射光波长一定时，散射光的强度与免疫复合物的含量成正比，当反应体系中保持抗体过量时，形成的免疫复合物含量又与抗原含量成正比。应用标准品制作标准曲线，通过检测散射光强度即可计算出待测标本中的抗原含量。根据散射光检测时间及检测方式的不同，散射免疫比浊试验又分为终点散射比浊试验和速率散射比浊试验两种。;2.终点散射比浊试验 所谓“终点”是指在抗原抗体反应达到平衡时测定散射光强度。在抗原抗体反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，计算出的结果会产生较大的误差。散射免疫比浊试验是避开了抗原抗体反应的不稳定阶段，在抗原抗体反应的最佳时段读数，将误差降到最低，且必须在免疫复合物相互聚合形成絮状沉淀前完成测定，否则光散射值降低，得出偏低的结果。终点散射比浊试验是在免疫反应进行到一定时间时测量其浊度，故亦称定时散射比浊试验。;2.终点散射比浊试验 终点散射比浊试验是在抗原抗体反应达到平衡时测定散射光强度。 其检测敏感度较高，达μg/L水平，高于透射免疫比浊试验，但低于速率散射比浊试验，可用自动化分析；在抗原抗体反应的第一阶段，反应时间较长，不合快速检测，计算时需减去本底值，在微量测定时，本底的干扰会影响准确测定。;3.速率散射比浊试验 所谓“速率”是指单位时间内抗原与抗体反应的速度或免疫复合物形成的量，而不是免疫复合物累积产生的量。 抗原与抗体混合后瞬间即发生反应，在抗体过量的情况下，抗原抗体反应速度由慢到快，在单位时间内产生的免疫复合物不断增多，随后逐渐减慢，在此变化过程中，在某一时间点抗原抗体反应速率最快，单位时间内产生的免疫复合物含量达到最大值，散射光强度变化亦最大，此即为速率峰。速率峰的峰值与抗原浓度成正相关。选取速率最大，且与被测抗原浓度变化呈线性关系的速率峰值，制作剂量-反应曲线，即可计算出被测抗原的浓度。 速率散射比浊试验具有速度快、灵敏度和精密度高