實驗五 层析实验.ppt

实验五 层析技术;层析法又称色谱法（Chromatography）;基本概念;几种常用的层析方法;薄层层析（thin layer chromatography）：将固定相（吸附剂）在玻璃板上或其它薄膜上均匀地铺成薄层，把要分析的样品加到薄层上，然后用合适的溶剂展开，而达到分离鉴定的目的。 优点是设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，并可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。 ;薄层层析分离脂类;【操作步骤】;2. 分配层析（partition chromatography）; 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。 滤纸纤维及其结合的水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。 纸层析对混合物进行分离时发生两种作用：第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤纸的有机相之间进行分配（即液-液分配）；第二种是滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配（即固-液分配）。虽然混合物的彼此分离是这两种因素共同作用的结果，但主要决定于液-液分配作用。 ;转氨基作用的验证——纸层析法;【操作步骤】;二、转氨酶反应 取离心管2只（短试管，10cm高度），编号1、2，各加肝匀浆10滴，然后将2号管置沸水浴中5分钟。 两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴，1%丙酮酸钠溶液10滴，0.25%一碘醋酸钾溶液5滴，同置40℃水浴中保温30分钟。 取出，向两管各加5% Hac溶液2滴，再同置沸水浴中5分钟，冷却后离心(2000 r/min，5 min)，将上清液移入另外同样编号的2ml小塑料离心管中备用。 ;三、层析验证;3．离子交换层析（ion-exchange chromatography）;离子交换层析分离混合氨基酸;本实验以天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg）混合物为例，利用磺酸型阳离子交换树脂（国产732树脂）将二者分别从混合物中分离。 天冬氨酸是酸性氨基酸，pI=2.98；精氨酸是碱性氨基酸，pI=10.76。 根据其等电点： 首先选择0.1M柠檬酸缓冲液（pH2.2），将它们都吸附在阳离子交换剂上， 再用0.1M柠檬酸缓冲液（pH 5.0）洗脱天冬氨酸， 用0.1M NaOH溶液洗脱精氨酸。;【操作步骤】;加样： 将混合氨基酸溶液0.1ml沿层析柱内壁缓缓加入，打开开关，使样品液缓缓流进柱床，流速为10滴/min。样品全部进入柱床后，用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液2ml，分两次先后加入洗柱。 洗脱Asp及检测： 洗脱：用0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，边加洗脱液边收集，流速 10滴/min，每管收集1ml。所有收集管分次用茚三酮反应检测氨基酸。 检测：在收集管中（含收集液1ml）加入 0.2%茚三酮溶液1ml； 0.5M，pH 5.0柠檬酸缓冲液1ml混匀， 置沸水浴中10min，溶液显兰紫色者为氨基酸阳性反应 茚三酮反应检测连续两管呈阴性，表明Asp被洗脱彻底，然后 开始进行用NaOH洗脱Arg ;5．洗脱Arg及检测： 洗脱：用0.1M NaOH以同样流速及收集体积洗脱Arg，并对各管收集液进行氨基酸。 检测：在收集管（含收集液1ml）中加入酸性茚三酮溶液1ml；0.5M pH5.0柠檬酸缓冲液1ml混匀，置沸水浴10min，观察颜色反应。 茚三酮反应检测连续两管呈阴性，表明Arg 被洗脱彻底。然后用PH2.2的柠檬酸缓冲液将离子柱洗到酸性状态。;4．凝胶层析（gel chromatography）;凝胶层析法分离血红蛋白和DNP－鱼精蛋白;【操作步骤】 1．凝胶的准备 称取l g Sephadex G–50，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，沸水浴中放置1小时，冷至室温备用。 2．装柱 取直径0.8～1.2cm，长25～30cm的层析柱一支，垂直安装于铁架台上。底部填少许玻璃纤维，下部装一“再”形夹以调节流速（见图4-1）。首先关闭“再”形夹，自顶部缓缓加入上述备用的Sephadex G–50 悬液，待底部凝胶沉积1～2cm时，打开“再”形夹，并边缓加Sephadex G–50悬液，边调整适当流速，至凝胶层积集约18cm高，停止加Sephadex G–50悬液，连通洗脱液，进行平衡（调整流速）。操作过程中，应防止气泡进入和凝胶分层现象。 3．样品制备 临上样前，将0.3ml血红蛋白溶液和0.5ml DNP–鱼精蛋白溶液混匀即可。 4．加样与洗脱 切断洗脱液，当层析柱中液面下降与凝胶表层平齐时，即用滴管将样品液缓缓沿柱壁加入，不使凝胶表层扰动，待样品液面与凝胶表层平齐时，再加少许蒸馏水，开始洗脱。注意观察层析柱中红色的血红蛋白与黄色的DNP–鱼精蛋白分离的情况，记录现象。 ; 5.高效液相层析(high p