第2章基因工程制药9,10,11,12,13节选编.pptVIP

第九节 高密度发酵;一、概 述;高密度发酵特点;一、影响高密度发酵的因素;4.温度：控制菌体生长，温控诱导表达（诱导时机和持续时间，对数生长期，2min） 5.代谢副产物： C源物质供应超过三羧酸循环或电子传递链能力，产生乙酸，抑制菌体生长和蛋白表达。采取流加补料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。;二、实现高密度发酵的方法;2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌 （1）阻断乙酸生产的主要途径：用基因敲除技术或基因突变技术使大肠杆菌的磷酸转乙酰酶（PTA）基因pta1和乙酸激酶(ACK)基因acka失活，使丙酮酸到乙酸的合成途径被中断。 （2）对碳代谢流进行分流：丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶Ⅱ可将丙酮酸转成乙醇，毒性小于乙酸。 （3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流：用基因敲除技术将磷酸转移酶系统（PST）酶Ⅱ的ptsG基因破坏，降低葡萄糖的摄取速率。 （4）引入血红蛋白基因：透明颤菌血红蛋白基因vgb导入大肠杆菌，提高氧传质能力，耐缺氧环境。;3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 rpoH基因编码大肠杆菌RNA聚合酶的r32亚基， r32亚基对多种蛋白水解酶的活力正调控。 构建rpoH基因缺陷的突变株，降低蛋白水解酶的活力。 ;第十节 基因工程药物的分离纯化;一、建立分离纯化工艺的根据（各种因素）;二 、分离纯化的基本过程;三.细胞破碎;四.固液分离;五、重组蛋白的分离纯化技术; 目的产物的分离纯化 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。; 产 物 特 性 　作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 　相对分子量 选择不同孔径的介质 　疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 　生物特异性 决定亲和配基 　溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 　稳定性 决定工艺采用温度及流程时间 ;分离纯化的方法：色谱分离方法;⑵反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）和 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）;常用固定相为硅胶烷基键合相。 流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。 由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。 ;疏水层析的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。 固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。 流动相为pH6～8盐水溶液。 ;高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介质的疏水基团产生疏水性作用而被吸附； 盐浓度降低时，蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。 与反相色谱相比，疏水层析回收率较高，蛋白质变性可能性小。 ;⑶亲和层析（affinity chromatography，AC）;⑷凝胶过滤层析;六、非蛋白质类杂质的去除;⑵热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖Gˉ菌细胞壁成分）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 ⑶病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除,紫外线照射使病毒失活。 ;七、选择分离纯化方法的依据; 产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化。 为了获得周质蛋白，经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。;⒉ 根据分离单元之间的衔接选择;随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。 层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤色谱。;⒊根据分离纯化工艺的要求来选择;第十一节 变性蛋白的复性;二、包含体的分离和溶解;三、包含体蛋白复性方法;;第十二节 基因工程药物的质量控制;一、医药生物技术产品质量保证的一般要点;二、 原材料的质量控制 确保编码药品的DNA序列的正确性 重组微生物来自单一克隆 所用质粒纯而稳定 保证产品质量的安全性和一致性。; 根据质量控制要求应了解以下特性： ⒈目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证； ⒉表达载体的名称、结构、遗传