专题-分子生物学技术在病理学上的应用.ppt

Application of Molecular Biology Technique in the Pathology ;; RNA Analysis Northern Blot : expressed genes RT-PCR: expressed genes In situ hybridization: gene location cDNA microarray : differentially expressed genes Bioinformatics ;Protein Analysis Western Blot: protein concentration Immunohistochemical Technique: protein location 2-D Electrophoresis: differerentially expressed proteins Bioinformatics ;双向电泳技术及其应用 ;双向电泳技术的原理 利用蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分 ;; 1985年G?rg A等发展了IPG-DALT系统双向电泳技术。它利用固相pH介质来形成一定范围的pH梯度。固相pH介质是一类丙烯酰胺的化合物，它与聚丙烯酰胺共价结合后形成一定范围的pH梯度。它不受脱水、重新水化和电场等因素的影响，因而具有不产生阴极漂移，pH梯度稳定，上样量大，重复性好，分辨率高等优点。目前世界上越来越多的实验室选择IPG-DALT系统双向电泳技术。 ;样品的预处理 样品的预处理是双向电泳的重要环节之一。双向电泳样品预处理的目的之一就是使样品在样品缓冲液中充分溶解、变性和还原，完全打破蛋白之间的相互作用。通常的样品缓冲液包括8M尿素，4%(w/v)CHAPS，50-100mM DTT和40mM Tris。然而这种“标准”的样品缓冲液并非对所有蛋白质的预处理都是理想的，特别是膜蛋白、与膜相连的蛋白质以及具有高抗性组织的蛋白(如头发和皮肤等)。;最近有许多可改变这些蛋白质溶解度的报道。如Rabilloud等介绍了用硫脲(2M)和尿素(5-7M)来增加蛋白的溶解。Herbert等用不带电荷的三丁基膦 (tributyl phosphine，TBP)代替含巯基的还原剂DTT，它既可增加蛋白的溶解，同时又不会因DTT在碱性环境带电而造成蛋白的丢失，特别是对于那些易于以二硫键相互作用的蛋白质(如角蛋白)。另外，样品的预处理还应考虑去除非蛋白质组分(如核酸、盐离子)。在细胞蛋白质变性之前应通过透析（或层析）和微量的 DNase/RNase来去除盐离子和核酸，以减少条纹和不均一背景的出现。 ;; IPG胶条经再水化和加样后可进行第一向等电聚焦。通常的聚焦参数包括时间、温度和电压。合适的聚焦时间取决于样品量、胶长和pH范围等。聚焦的温度最好在20℃左右。因为温度??低(4℃以下)，尿素会结晶失去其原有的作用；而温度过高则会造成尿素结构的破坏，产生异硫氰酸盐而使蛋白发生氨基甲酰化，最终导致蛋白质等电点的改变。在等电聚焦过程中通常先设置低电压促使样品进入凝胶和去除过量的盐离子，然后再用高电压进行等电聚焦。若采用专门的双向电泳装置和附件进行等电聚焦，可先按说明书进行操作和设置各参数，再经过不断的摸索得出最佳的聚焦条件。 ;平衡 平衡的目的是使蛋白质分子与SDS充分的相互作用，使蛋白质根据分子量的大小而进行第二向迁移。一般的步骤是先在第一步平衡缓冲液（含DTT和SDS）中平衡10~15min，再在第二步平衡缓冲液（含碘乙酰胺和SDS）中平衡10~15min。平衡的时间不宜过长。因为第一向等电聚焦使用的是非限制性凝胶，孔径较大，平衡时间过长会导致蛋白分子的扩散，使结果出现横纹。Yan等发现通过改变平衡缓冲液pH值(pH8.0)，烷基化试剂的浓度（125mM碘乙酰胺）和平衡时间（15min）可将几乎所有的Cys烷基化，这个修改不但不改变双向电泳蛋白质组模式，而且更利于在基质辅助激光解析电离—飞行时间质谱(MALDI—TOF—MS)分析时进行蛋白消化。 ; IPG胶条的转移 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 染色 银染 考马斯亮蓝染色 荧光标记 放射自显影;凝胶图像分析及数据处理 SDS凝胶经染色后，可用图像扫描仪或数码照相系统等把复杂的蛋白质图谱用数字化格式捕获并为下一步分析提供依据。利用凝胶图像分析软件进行斑点检测、背景消除和匹配分析以找出差异表达的蛋白，通过质谱及N端测序等鉴定差异蛋白质点。常用的分析软件有PDQuest、ImageMaster 2-D、MelanieⅡ和Phoretix 2D等 ;基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 （