FCM原理及临床应用教程.ppt

流式细胞术检测原理及在 临床医学中的应用 ; 流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。;FCM的工作原理; 1.液流系统：由样本和鞘液组成。 待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的McAb染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液 (sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞液柱。 ;;鞘液：辅助样本流能被正常检测的基质液 作用： 1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性； 2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。;2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。 激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。 检测信号： 散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。;;FCM检测信号;荧光信号;3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。 通过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析 存储、显示。 具有智能化、自动化特点。 ;免疫荧光标记;常用免疫荧光染料组合;荧光补偿： 每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动跟踪调节补偿。; 流式细胞仪的基本功能 细胞表型分析(包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析 DNA含量及细胞周期分析：DNA content analysis，如细胞凋亡检测 细胞分选 cell sorting 自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测：如用Hep-2细胞检测抗核抗体。; 临床免疫学 临床血液学 临床肿瘤学 血栓与止血 骨髓和器官移植 基础医学研究; FCM在临床免疫学中的应用 (1) 淋巴细胞亚群分析 T细胞： CD3+ CD4+ (Th) CD8+ (Ts/Tc) B细胞： CD19+ NK细胞： CD3- CD16+ CD56+;(2) 淋巴细胞亚群细分 T细胞：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+ Th：CD4+ CD29+ B细胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+;根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+、CD8+分为 ? CD4+: Th1: CD4+ IFN-r+ Th2: CD4+ IL4+ Th0: CD4+ IFN-r+ IL4+ ? CD8+: Tc1: CD8+ IFN-r+ Tc2: CD8+ IL4+ Tc0: CD8+ IFN-r+ IL4+ ;辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义 Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。 Th2细胞 ：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。;(3) 活化淋巴细胞亚群 活化总T细胞： CD3+ /HLA—DR+ 静止总T细胞： CD3+ /HLA—DR- 活化CD4+细胞：CD4+ /HLA—DR+ 活化CD8+细胞：CD8+ /HLA—DR+ 活化诱导分子： CD69 白细胞介素2低亲和力受体： CD25 CD25+ /CD3+：活化T细胞 CD25- /CD3+：静止T细胞;(4) 淋巴细胞功能分析：细胞介导细胞毒试验、细胞内细胞因子的测定 自身免疫性疾病 变态反应性疾病 免疫缺陷性疾病 感染性疾病(病毒、细菌、寄生虫感染) 免疫治疗监测