4蛋白质分子生物学改造-表达.pptVIP

蛋白质的化学修饰：通过活性基团的引入或去除使蛋白质化学(一级)结构的发生改变的过程。 非必需部分的修饰：不影响蛋白质的生物活性。 必需部分的修饰：影响蛋白质的生物活性 。;;;第一节 蛋白质的分子生物学改造; 对于存在于自然界中的任何蛋白质来说，采用重组DNA技术克隆其基因，在特定宿主细胞中进行表达，可以获得运用于商业用途的纯化的产品。然而，这些蛋白质的理化特性常常不能适应实际需求，这是就需要采取适宜手段对这些蛋白质的理化特性进行改造。; 蛋白质工程设计可以采用定点突变和体外分子定向进化两种方式对天然酶分子进行改造。 定点突变需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。 体外定向进化是在尚不知道蛋白质的空间结构，或者根据现有的蛋白质结构知识??不能进行有效的定点突变时，借鉴实验室手段在体外模拟自然进化的过程，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能。 ; 定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。 ;;Step 2: overlap and extension;定点突变的应用一：通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性;定点突变的应用二：通过引入二硫键提高蛋白的稳定性; 绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或蓝光激发时，可高效发射绿光，且无需底物和辅因子。GFP可作为一种“荧光标签”被用来研究目标蛋白的定位及移动情况。 ;诺奖获得者：钱永健、下村修、约翰森 ; ;GFP的不同颜色; 然而，定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因而对酶功能的改造较为有限。 同时，已有的结构与功能相互关系的信息远远不能满足当今人们对蛋白质新功能的要求，因此目前采用体外分子定向进化的方法来改造酶蛋白的研究越来越多，并已在短短几年内取得了令人瞩目的成就。 ;二、蛋白质的体外分子定向进化; 易错PCR（Error prone PCR）是一种相对简单、快速、廉价的随机突变方法。它通过改变PCR反应条件，如降低一种dNTP的量（降至5%-10%）、以dITP来代替被减少的dNTP、增加Mn++和Mg++的浓度或使用低保真度的DNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。 ; DNA shuffling于1994年由美国的 Stemmer提出。这种方法不仅可以对从随机突变文库中筛选出来一组突变基因人为进化，还可以将具有结构同源性的几种基因进行体外重组（Family shuffling)，共同进化出一种新的蛋白质。 通过这种方法产生的多样性文库，可以有效积累有益突变，排除有害突变和中性突变，同时也可实现目的蛋白质多种特性的共进化。 ;; DNA shuffling过程示意图 ; 当DNA shuffling用来重组一系列进化上相关的基因时，就称为Family shuffling。 应用举例：当将4种头孢菌素酶基因进行Family shuffling时，酶活最高可增加540倍，而单基因shuffling只增加8倍。 ; 最近两年在DNA shuffling的基础上又延伸出了StEP(Staggered extension process)重组、随机引物体外重组(Random-priming in vitro recombination, RPR)、临时模板随机嵌合生长(Random chimeragenesis on transient templates, RACHITT)等定向进化方法。 ;突变体的筛选;;;;;;三、基因的融合;为蛋白质的表达和纯化提供方便 与其它不同功能的蛋白质融合，产生新的多功能蛋白 与报告分子共表达，研究蛋白定位及转基因表达 防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解 改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GST 蛋白表达的空间定位：信号肽 蛋白质结构和功能的研究 获得蛋白质的途径（通过体外切割）;（一）基因融合的策略;2. 融合蛋白接头设计和选择;;; 融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为“亲和尾”（Affinity tail）的编码序列相连接，这段“亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。 poly-Arg poly-His ;蛋白纯